HPLC法測(cè)定益宮顆粒中阿魏酸的含量

高松紅 單柏宇 徐 陽 孫 瑩*

（1 長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031；2 白城市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 白城 137000）

益宮顆粒是由黃芪、當(dāng)歸、續(xù)斷、益母草、丹參、黨參、香附、敗醬草八味中藥組成，具有溫經(jīng)止痛和活血化瘀的功效，對(duì)于生產(chǎn)后的虛弱受寒所致的小腹疼痛和惡露不絕等癥具有良好療效[1-3]。處方中的黃芪與當(dāng)歸配伍，可以補(bǔ)益氣血、培補(bǔ)元?dú)狻⒄{(diào)和營(yíng)衛(wèi)，養(yǎng)氣以生血、治從補(bǔ)氣以行血，平衡機(jī)體內(nèi)的陰陽。續(xù)斷則具有強(qiáng)經(jīng)補(bǔ)腎之功效，可促進(jìn)津液和血液歸于腎經(jīng)，攝而防止外漏[1-3]。黨參能夠調(diào)節(jié)脾胃、健運(yùn)脾氣、補(bǔ)血益氣。益母草與丹參配合使用具有祛瘀生新的藥效。敗醬草具有排出淤血和去除濁氣的作用。香附具有行氣化血和舒肝養(yǎng)肝的作用。

通過大量的臨床研究表明，益宮顆粒可作為治療產(chǎn)后出血多，惡露時(shí)間長(zhǎng)的首選藥，但是針對(duì)此藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究卻不健全[4-8]。阿魏酸是君藥當(dāng)歸的主要活性成分，也是《中國(guó)藥典》中含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。通過研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸及衍生物具有多方面藥理作用和生物活性，能清除自由基，促進(jìn)清除自由基的酶的產(chǎn)生，增加谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶和醌還原酶的活性，并抑制酪氨酸酶活性，來調(diào)節(jié)人體生理功能[11-14]。阿魏酸可以抗血小板聚集，抑制血小板5-羥色胺釋放和血小板血栓素A2（TXA2）的生成，同時(shí)可增加前列腺素活性，可鎮(zhèn)痛，并可以緩解血管痙攣等[15]。是治療白細(xì)胞減少和心腦血管疾病等癥藥品的基本原料，且毒性較低，在醫(yī)藥、保健品、化妝品原料和食品添加劑等方面有著廣泛的用途。建立HPLC法測(cè)定其在益宮顆粒中的含量，為進(jìn)一步質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。見圖1。

1 材 料

圖1 阿魏酸結(jié)構(gòu)

SHIMADZU LC-2030型高效液相色譜儀（日本島津儀器設(shè)備有限公司）；RE 52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；AUW-120D型電子天平（日本島津儀器設(shè)備有限公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

阿魏酸（中國(guó)藥品食品檢定研究院，批號(hào)：110773-200611）；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；水（純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；磷酸、無水乙醇（均為分析純，北京化工廠）。

益宮顆粒（陜西健民制藥有限公司，批號(hào)見表2）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：色譜柱：Diamonsil C18 （4.6 nm×250 nm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）；體積流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量均為10 μL。理論塔板數(shù)按阿魏酸計(jì)算不低于3000，在此條件下，阿魏酸與其他物質(zhì)分離度均＞1.5，符合藥典規(guī)定，空白色譜圖無干擾，供試品中阿魏酸色譜峰通過HPLC-DAD檢測(cè)器測(cè)定，色譜峰純度＞990，專屬性良好。結(jié)果見圖2、3、4。

2.2 對(duì)照品溶液的配制：精密稱約5 mg阿魏酸對(duì)照品，置于100 mL容量瓶中，適量甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，精密吸取0.2～10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，制備成1 mL約含阿魏酸0.01 mg的對(duì)照品溶液。

圖2 空白色譜圖

圖3 阿魏酸對(duì)照品色譜圖

圖4 益宮顆粒供試品色譜圖

2.3 供試品溶液的配制：取益宮顆粒，粉碎，精密稱定5 g，加20 mL的無水乙醇超聲提取30 min，過濾，收集濾液，重復(fù)提取3次，合并濾液，于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移置10 mL量瓶中，定容至刻度，即得。

2.4 線性關(guān)系考察：精密稱取25.75 mg阿魏酸對(duì)照品，置于100 mL量瓶中，適量甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，分別吸取2、1、0.5、0.25、0.2、0.1 mL，置于10 mL量瓶中，適量甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。即濃度為0.05150 mg/mL、0.02575 mg/mL、0.012875 mg/mL、0.0064375 mg/mL、0.00515 mg/mL、0.00258 mg/mL的線性關(guān)系對(duì)照品溶液。按照“2.1”項(xiàng)下方法，將各濃度線性關(guān)系對(duì)照品分別注入高效液相色譜儀中，記錄色譜峰的峰面積。以色譜峰面積為Y軸，溶液濃度為X軸作圖，得到阿魏酸的回歸方程為Y=26352X+10.3823，r=0.9998（n=6），表明阿魏酸在0.00258～0.05150 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)：按照“2.1”項(xiàng)下方法，分別精密吸取對(duì)照品溶液和益宮顆粒供試品溶液（批號(hào)：201606308）各10μL，分別連續(xù)6次注入高效液相色譜儀中，記錄色譜峰的峰面積，結(jié)果阿魏酸對(duì)照品和益宮顆粒供試品色譜峰面積的RSD值分別為0.98%和1.62%，結(jié)果表明此方法具有良好的精密度。

2.6 穩(wěn)定性考察：分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)，按照“2.1”項(xiàng)下方法分別精密吸取對(duì)照品溶液和益宮顆粒供試品溶液（批號(hào)為：201606308）10 μL，依次進(jìn)入高效液相色譜儀中，記錄色譜峰面積，結(jié)果阿魏酸對(duì)照品和益宮顆粒供試品色譜峰面積的RSD值分別為0.47%和1.68%（n=8），結(jié)果表明供試品溶液中阿魏酸在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：精密稱取益宮顆粒（批號(hào)：201606308）6份，每份約10 g，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，測(cè)定阿魏酸色譜峰面積，并進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果其含量的RSD值為1.84%，結(jié)果表明此方法具有良好的重復(fù)性。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱取阿魏酸對(duì)照品6份，每份約15 mg，至100 mL容量瓶中，適量甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，精密吸取0.5 mL，分別加入6份約2.5 g的益宮顆粒（批號(hào)：201606308）中，按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算阿魏酸回收率。結(jié)果其平均回收率為100.47%，RSD值為0.70%（n=6），表明此方法具有良好的回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定：選取3批益宮顆粒，按照“2.3”和“2.2”項(xiàng)下方法對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行制備，分別注入液相色譜儀10 μL，按照外標(biāo)法對(duì)不同批次的供試品中阿魏酸的含量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 益宮顆粒中阿魏酸的含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

通過對(duì)比熱回流提取法、超聲提取法、索氏提取法和浸漬法等提取方法配合石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和無水乙醇等試劑進(jìn)行提取[16-18]，最終確定以無水乙醇為提取溶劑，采用超聲提取法進(jìn)行提取，此提取方法可以快速、準(zhǔn)確的將阿魏酸從益宮顆粒中提取出來。

在色譜條件篩選上，本實(shí)驗(yàn)選取360 nm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，在此波長(zhǎng)下阿魏酸具有良好的吸收，且在益宮顆粒供試品中，具有良好的分離度，符合藥典規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比乙腈-水（或磷酸水）、甲醇-水（或磷酸水）、乙腈-甲醇-水（或磷酸水），最終確定乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）為最佳的色譜條件，阿魏酸在酸性流動(dòng)相中具有更好的峰型和分離效果。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同色譜柱溫度進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)較高的溫度對(duì)阿魏酸的分離效果具有較好的作用，但較高的色譜柱溫度會(huì)影響色譜柱的使用時(shí)間，最終確定35 ℃為最佳的色譜柱溫度。

益宮顆粒具有良好的藥效作用，且被廣泛應(yīng)用，但并無一種HPLC相關(guān)的質(zhì)量控制方法。阿魏酸具有良好的藥效作用，在多方面具有良好的藥效作用，是益宮顆粒中君藥當(dāng)歸中的主要藥效成分，往往以阿魏酸的含量來評(píng)價(jià)當(dāng)歸的質(zhì)量，故本實(shí)驗(yàn)建立一種測(cè)定益宮顆粒中阿魏酸含量的方法，從而評(píng)價(jià)益宮顆粒的質(zhì)量，為其質(zhì)量控制奠定研究基礎(chǔ)。