LDH-A乙酰化在結直腸腺癌組織中的表達及意義△

鄭鴻，祝子華

1復旦大學附屬腫瘤醫院閔行分院化療科，上海200240

2復旦大學附屬閔行醫院消化科，上海2011990

大多數情況下，腫瘤細胞對葡萄糖的攝入量明顯高于正常細胞，即使在不缺氧的情況下也是優先發生糖酵解，從而產生乳酸，這種現象稱為Warburg效應[1]。乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase-A，LDH-A）是糖酵解的重要代謝酶，有研究表明，和正常組織相比，LDH-A在很多腫瘤組織中呈高表達，例如結腸癌、肺癌、乳腺癌等，提示LDH-A與腫瘤的發生、發展存在著密切的關系[2-4]。既往對于LDH-A的研究主要集中在轉錄水平方面，隨著蛋白質修飾的研究成為熱點，LDH-A的乙酰化研究日漸深入，根據已有的質譜數據，LDH-A存在8個潛在的乙酰化位點[5]。Zhao等[10]進一步發現LDH-A的乙酰化主要發生于LDH-A第5位點賴氨酸殘基上，LDH-A乙酰化能夠影響LDH-A酶的活性和蛋白穩定性，還能夠促進LDH-A通過分子伴侶介導的溶酶體途徑降解，在胰腺癌中LDH-A的乙酰化水平降低，由此使得LDH-A酶活力增加和LDH-A積累，從而促進了腫瘤的能量代謝，加速了腫瘤的生長和轉移。有關LDH-A乙酰化與結直腸腺癌關系的報道較為少見。本研究探討了LDH-A乙酰化在結直腸癌組織中的表達情況，并分析了LDH-A乙酰化與結直腸腺發生、發展的相關性，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2017年5月由復旦大學附屬閔行醫院提供的結直腸腺癌患者的結直腸腺癌組織標本。納入標準：患者均經手術切除和病理學檢查確診為結直腸腺癌；患者的臨床資料完整。排除標準：原位癌患者；具有第二原發腫瘤病史的患者；混合性腺磷癌患者。根據納入及排除標準，本研究共納入結直腸腺癌患者40例。40例結直腸腺癌患者中，男26例，女14例；年齡為42～91歲，中位年齡為68歲；分化程度：中高分化24例，低分化16例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期12例；Ⅲ～Ⅳ期28例。另選取相應的40例癌旁正常組織（距癌組織﹥5 mm）標本作為對照。

1.2 方法

1.2.1 指標檢測方法 乙酰化LDH-A抗體由復旦大學生命科學研究院提供。檢測方法：免疫組織化學檢測。具體操作：①脫蠟水化，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3次，每次2 min。②抗原修復，用PBS沖洗3次，每次2 min。③滴加100 μl的過氧化物酶封閉劑，室溫下孵育10 min，用PBS沖洗3次，每次2 min。④滴加100 μl的一抗，室溫下孵育30～60 min，PBS沖洗3 min，每次2 min。⑤滴加100 μl的二抗（乙酰化LDH-A抗體按1∶10 000稀釋），室溫下孵育1～2 h。PBS沖洗3 min，每次2 min。⑥配制二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）工作液，取DAB色原和DAB緩沖液各50 μl，加入 1 ml蒸餾水，混勻備用。⑦取 100 μl的DAB工作液滴加在組織膠片上顯色2～10 min。⑧自來水沖洗，終止顯色。⑨用蘇木紫染色液復染，分化，返藍。⑩顯微鏡下觀察染色結果，并對陽性染色面積進行分析并拍照。

1.2.2 結果判定標準 在顯微鏡下觀察結直腸腺癌組織中乙酰化LDH-A蛋白的陽性表達情況，比較不同臨床特征結直腸腺癌患者乙酰化LDH-A蛋白的陽性表達情況。免疫組化結果判定：乙酰化LDH-A蛋白主要表達于細胞漿，部分表達于細胞核，呈現棕黃色顆粒即為陽性表達。在200倍顯微鏡下，每張組織切片隨機選擇3個視野，由兩名病理科醫師在未知任何病理資料和臨床資料的情況下對免疫組織化學染色結果進行評估。染色強度評分標準：無染色為0分，染色強度弱為1分，染色強度中等為2分，染色強為3分；陽性細胞所占百分比評分標準：﹤5%為0分，5～25%為1分，26～50%為2分，51～75%為3分，﹥75%為4分。兩項評分的乘積為最終得分，0～7分則為陰性表達，8～12分則為陽性表達。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乙酰化LDH-A蛋白表達情況的比較

結直腸癌組織中的乙酰化LDH-A蛋白陽性表達率為22.5%（9/40），低于癌旁正常組織的47.5%（19/40），差異有統計學意義（χ2=5.50，P﹤0.05）。

2.2 不同臨床特征結直腸癌患者乙酰化LDH-A蛋白表達情況的比較

Ⅰ～Ⅱ期結直腸腺癌組織標本中乙酰化LDHA蛋白的陽性表達率高于Ⅲ～Ⅳ期的結直腸腺癌組織，差異有統計學意義（χ2=3.97，P﹤0.05）。不同年齡、性別、分化程度結直腸腺癌患者中乙酰化LDH-A蛋白的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征結直腸癌患者乙酰化LDH-A蛋白表達情況的比較

3 討論

近年來，結直腸癌的發病率呈逐漸上升趨勢，但其發病的確切機制尚不明確。腫瘤能量代謝的改變是惡性腫瘤細胞重要的代謝特征[6]。與正常細胞相比，腫瘤細胞顯著的代謝特點是腫瘤細胞能夠通過葡萄糖酵解大量攝取葡萄糖，從而產生能量以滿足其增殖的能量需求，并產生較多的乳酸。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是一種糖酵解酶，在腫瘤細胞糖酵解過程中具有重要的作用。在腫瘤細胞中，大部分的丙酮酸不是作為能量原料進入線粒體進行三羧酸循環和氧化磷酸化來產能的，而是經LDH轉變為乳酸，通過糖酵解滿足腫瘤的快速生長的；過量的乳酸對細胞外基質具有分解破壞的作用，促進了腫瘤細胞與間質細胞的相互作用，有利于腫瘤細胞的浸潤與轉移，并誘導腫瘤血管的形成[7-8]。因此，腫瘤的生長與LDH密切相關。LDH是一個多基因位點的同工酶，其中，LDH-A是其中的一種亞基類型。LDH-A的表達水平越高，患者的預后越差。Le等[8]報道了在腫瘤患者體內通過RNA干擾LDH-A或藥物抑制LDH-A能夠阻止腫瘤的進展。Fantin等[9]發現腫瘤細胞中的LDH-A水平下降，腫瘤的生長受到抑制，荷瘤小鼠的存活期延長。LDH-A抑制劑則能夠減少腫瘤細胞中腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的產生，增強細胞內的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，促進腫瘤細胞的調亡，從而抑制腫瘤的生長[10]。這些研究均說明了LDH-A在腫瘤的代謝和腫瘤的發生中發揮了重要的促進作用，并可能成為潛在的腫瘤治療靶點。

然而，以往的研究主要集中于LDH-A轉錄水平的調控。但近年來，細胞中基因轉錄、信號轉導、生物代謝和物質運輸等各種途徑都離不開蛋白質翻譯后修飾的調控。其中，蛋白質的乙酰化作為一種重要的翻譯后修飾受到越來越多的關注，如非組蛋白的乙酰化，尤其是代謝酶的乙酰化研究成為熱點。這些代謝酶參與細胞中的各種代謝途徑，如糖代謝、脂類代謝、氨基酸代謝等，從而影響細胞代謝和疾病的發生。乙酰化調控代謝酶的方式多種多樣，例如調節代謝酶的催化活性，影響代謝酶的蛋白穩定性，控制代謝酶的亞細胞定位等，從而影響細胞的代謝和疾病的發生。

本研究結果表明，結直腸癌組織中的乙酰化LDH-A蛋白陽性表達率為22.5%（9/40），低于癌旁正常組織的47.5%（19/40）（P﹤0.05）。這表明乙酰化LDH-A可能對腫瘤細胞的增殖發揮了負性調控作用，提示采用乙酰化類似物替代內生性的LDH-A可能降低腫瘤細胞的增殖能力。這與相關研究發現在胰腺癌中，乙酰化LDH-A不僅能夠減少LDH-A的催化活性[10-11]，還能夠降低LDH-A蛋白的表達水平的結論相一致。這一現象可能為今后臨床靶點治療提供新思路。

此外，本研究還發現，Ⅰ～Ⅱ期結直腸腺癌患者的結直腸腺癌組織中乙酰化LDH-A蛋白的陽性表達率高于Ⅲ～Ⅳ期結直腸腺癌患者（P﹤0.05）。不同年齡、性別、分化程度結直腸腺癌患者的結直腸腺癌組織中乙酰化LDH-A蛋白的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）。表明在結直腸腺癌早期，其LDH-A乙酰化的表達水平高于結直腸腺癌晚期，提示LDH-A乙酰化可能在結直腸癌的發展中存在一定的下調。

綜上所述，本研究結果發現結直腸腺癌乙酰化水平在結直腸癌組織中呈低表達，提示其與結直腸癌的發生可能存在一定的關系，LDH-A乙酰化可能在結直腸癌的發展中起到負性調節的重要作用，即LDH-A乙酰化可能抑制結直腸腺癌的發生和發展。