加州鱸出血病嗜水氣單胞菌的分離鑒定、 致病性和體外抑菌藥物研究

葉偉東，郭 成，曹海鵬，楊先樂

(1.上海海洋大學國家水生動物病原庫， 上海 201306； 2.上海海洋大學 上海水產養殖工程技術研究中心，上海 201306； 3.水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，上海 201306； 4.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心， 上海 201306)

加州鱸(Micropterussalmonides)肉質鮮美，營養豐富，深受消費者青睞，是我國重要的淡水養殖品種。據統計[1]，2016 年我國加州鱸養殖總產量達到37萬多噸。然而，隨著養殖密度和養殖規模的不斷增大，加州鱸養殖環境日趨惡化，細菌性病害頻發，阻礙了加州鱸養殖業的健康發展。其中，出血病是加州鱸主要的細菌性病害之一，具有季節長，流行廣，發病率高，死亡率極高的特點，給養殖戶造成了巨大損失[2]。目前，已有研究表明，嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是草魚(Ctenopharyngodonidella)、鳊(Parabramispekinensis)、黃鱔(Monopterusalbus)等多種水產動物細菌性出血病的病原菌[3-5]，也是加州鱸爛身病的病原菌[6]，但嗜水氣單胞菌引起加州鱸出血病鮮見詳細報道。本實驗從患出血病的加州鱸肝臟組織中分離到嗜水氣單胞菌LY4，通過人工回歸感染試驗確定了其致病性，采用API 20E生理生化鑒定和16S rRNA序列分析對其進行了鑒定，采用紙片擴散法測定了其耐藥性，并采用二倍稀釋法評價了35種中草藥水提取液對其產生的體外抑菌作用，進一步豐富了加州鱸出血病的病原學研究資料，為加州鱸出血病的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

患病加州鱸，平均體重460 g，12尾，采集自上海某養殖場；健康加州鱸，平均體重62.8 g，購于上海青浦某養殖場；API 20E細菌生化鑒定試劑條，由法國梅里埃公司生產；藥敏紙片，購于杭州濱河微生物試劑有限公司；試驗所用中草藥購自河北省安國市御顏坊中藥材有限公司。

1.2 病原菌的分離、純化與鑒定

1.2.1 病原菌的分離

無菌條件下取試驗魚的肝、腎等組織，采用傳統方法[7]在營養瓊脂平板上進行病原菌株的劃線分離，28 ℃恒溫培養24 h后，挑取形態一致的優勢單菌落進一步純化，接種于營養瓊脂斜面，28 ℃恒溫培養24 h后4 ℃冰箱保藏備用；與此同時，將純化的病原菌株接種于脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板，觀察菌落周圍是否出現清晰、透明的溶蛋白圈，以確定病原菌株是否產生胞外蛋白酶[8]。

1.2.2 人工回歸感染試驗

用無菌生理鹽水分別洗下營養瓊脂斜面上病原菌株的菌苔，用稀釋涂布平板法測定并調節菌懸液濃度為5.0×103～5.0×107CFU/mL，然后參照安偉等[9]的方法對健康加州鱸進行腹腔注射，每組魚注射15尾，每尾注射0.2 mL。對照組注射相同劑量的無菌生理鹽水，連續7 d觀察魚的發病及死亡情況，記錄死亡數目，并根據概率單位圖解法[10]測定病原菌株對加州鱸的半數致死劑量(LD50)。試驗中及時檢查并撈出死魚，觀察病癥并進行病原菌再分離，驗證再分離菌株與原病原菌株的一致性。

1.2.3 病原菌的鑒定

參照徐輝等[11]的方法采用API 20E細菌鑒定系統對病原菌株進行生理生化鑒定。同時，以病原菌株的基因組DNA為模板，對其16S rRNA進行PCR擴增。其中，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR的擴增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物的純化與測序由上海杰李生物科技有限公司完成。將測得序列用DNAMAN軟件編輯后，在美國國立生物技術信息中心(NCBI)中利用BLASTN軟件與GenBank基因庫中已知的16S rRNA基因序列進行同源性比較，選取同源性較高的序列并利用軟件Mega 5.0進行多重比較后通過鄰接法構建系統發育樹。

1.3 病原菌對抗生素的耐藥性檢測

參照KB紙片擴散法[12]進行，即以涂布法接種致病菌株，然后將藥敏紙片貼在培養基上，28 ℃培養24 h后，測定抑菌圈直徑(mm)，根據杭州濱河微生物試劑有限公司提供的《紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑判斷標準》，確定病原菌株對抗生素的耐藥性。

1.4 中草藥對病原菌最小抑菌濃度的測定

采用二倍稀釋法[13]測定35種中草藥(表1)水提取液對病原菌株的最小抑菌濃度(MIC)。即取含有2 mL無菌營養肉湯的試管14支并編號，于第1管中加入2 mL中草藥水提取液(終質量濃度為1 000 mg/mL)至終質量濃度為500 mg/mL，混勻后再取2 mL加入第2管中至終質量濃度為250 mg/mL，依次倍比稀釋直至第13管(其中2 mL棄用)，分別至終質量濃度為125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.97、0.49、0.24、0.12 mg/mL，第14管為陽性對照，不加中草藥水提取液，然后分別接種病原菌株至終濃度5.0×105CFU/mL，于28 ℃恒溫培養24 h后觀察結果。以相同培養條件的空白無菌營養肉湯作為陰性對照。把無菌生長、稀釋度最大的中草藥水提取液質量濃度作為病原菌株的最小抑菌濃度。其中，中草藥水提取液的制備參照張顯忠等[14]的方法，即將35種中草藥分別稱取100 g，加1～2 L蒸餾水，浸泡30 min后煎煮，煮沸后文火煎30 min，用4層紗布過濾取藥液，藥渣再加蒸餾水0.5～1 L，重復以上操作取藥液。合并兩次藥液，用文火濃縮至100 mL，即制成終質量濃度為1 000 mg/mL的中草藥水提取液。

表1 試驗用中草藥名錄Tab.1 Tested Chinese herbs

2 結果

2.1 病原菌的分離與致病性

從患病加州鱸肝臟組織中分離到1株病原菌(LY4)，在脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板形成的菌落周圍具有清晰、透明的溶蛋白圈，說明能夠產生胞外蛋白酶。人工回歸感染試驗結果(表2)表明，菌株LY4對健康加州鱸具有致病性，回歸感染發病的加州鱸也出現體表出血、充血等與自然發病魚相同的病癥，而且從回歸感染致死的魚體內又可分離到與原菌株一致的菌株，表明菌株LY4是加州鱸出血病的病原菌。根據概率單位圖解法建立的死亡概率(Y)與菌液濃度對數(X)的關系曲線方程：Y= 0.984X-0.659 5，菌株LY4對健康加州鱸的LD50為5.7×105CFU/mL。

表2 菌株LY4對加州鱸的人工回歸感染實驗結果Tab.2 Artificial infection of strain LY4 to healthy M.salmoides

2.2 病原菌的鑒定

API 20E細菌鑒定系統對菌株LY4的生理生化鑒定結果表明(表3)，菌株LY4為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，可信度為99.9%。此外，通過對菌株LY4的16S rRNA基因進行PCR擴增，獲得了1 400 bp大小的片段，其在GenBank上的序列號為：KY694995。基于菌株LY4 16S rRNA基因序列構建的系統發育樹(圖1)進一步表明，菌株LY4與嗜水氣單胞菌ATCC 49140(GenBank序列號：AY987754)的親緣關系最近。綜合生理生化特性鑒定與16S rRNA基因序列分析的結果，最終判定菌株LY4為嗜水氣單胞菌。

表3 菌株LY4的生理生化特性Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of strain LY4

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性；“d”表示種間存在差異

圖1 基于菌株LY4 16S rRNA基因序列的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain LY4 括號中的序號代表菌株的GenBank登錄號;分支點上的數字代表計算1000次聚類到一起的幾率;標尺刻度代表0.05%的序列差異

2.3 病原菌的耐藥性

實驗結果表明(表4)，菌株LY4對青霉素、阿莫西林、甲氧嘧啶、四環素、多西環素、呋喃唑酮等6種抗生素耐藥，對紅霉素、卡那霉素等2種抗生素中等敏感，對恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、新霉素、慶大霉素、鏈霉素、頭孢他啶、頭孢噻肟等9種抗生素高度敏感。

表4 菌株LY4的藥敏特性Tab.4 Antibiotic susceptibility of strain LY4

注：“S”表示高度敏感；“I”表示中度敏感；“R”表示耐藥

2.4 中草藥對病原菌的最小抑菌濃度

由表5可知，五倍子、烏梅、地榆等3種中草藥水提取液對菌株LY4具有良好的抑菌作用。具體表現在：五倍子水提取液、烏梅水提取液、地榆水提取液對菌株LY4的MIC分別為7.81、15.63和15.63 mg/mL，而赤芍水提取液對菌株LY4的MIC為31.25 mg/mL，石榴皮、山楂、熟地黃等中草藥水提取液對菌株LY4的MIC均為62.5 mg/mL，其他28種中草藥的水提取液對菌株LY4的MIC均不低于125 mg/mL。

表5 中草藥水提取液對菌株LY4的最小抑菌濃度Tab.5 MICs of water extracts from Chinese herbs against strain LY4 mg/mL

續表5

3 討論

3.1 嗜水氣單胞菌的鑒定

一般來說，嗜水氣單胞菌菌株不同，其理化特性也具有差異。李圓圓等[16]分離的鱘源嗜水氣單胞菌與張曉君等[17]分離的草魚源嗜水氣單胞菌就表現出不同的鼠李糖發酵特性。因此，嗜水氣單胞菌的鑒定方法通常是在生理生化鑒定的基礎上，再進行16S rRNA基因序列分析鑒定[18]。本實驗綜合生理生化鑒定與16S rRNA 基因序列分析，判定菌株LY4為嗜水氣單胞菌，鑒定結果準確可靠。此外，本實驗發現菌株LY4與樊海平等[7]分離的鰻源嗜水氣單胞菌JS70322NA、張友平等[15]分離的蝦源嗜水氣單胞菌MrM0602在利用檸檬酸鈉特性方面也存在差異，可能與地區、氣候、水質條件及實驗室培養條件等方面的不同有關[19]。

3.2 嗜水氣單胞菌的毒力與致病性

嗜水氣單胞菌的不同菌株間通常存在著毒力差異。王玉娟等[20]從患病革胡子鯰分離的嗜水氣單胞菌1403的LD50為6.32 ×106CFU/mL，張慶華等[21]從患病金錢魚分離的嗜水氣單胞菌Ah201416的LD50為7.35×107CFU/mL。本實驗分離的嗜水氣單胞菌LY4的LD50為5.7×105CFU/mL，其毒力高于嗜水氣單胞菌1403、嗜水氣單胞菌Ah201416，可能與嗜水氣單胞菌的不同菌株攜帶的毒力基因的種類和數量不同有關[22]。

胞外蛋白酶是嗜水氣單胞菌的重要致病因子，主要由具有較強致病性的絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶等多種蛋白酶組成[15]。儲衛華等[23]研究表明，嗜水氣單胞菌胞外蛋白酶能夠引起魚體出現出血、充血等病癥。本實驗結果表明，嗜水氣單胞菌LY4具有胞外蛋白酶活性，而且回歸感染的魚體也具有出血、充血等病癥。因此，嗜水氣單胞菌LY4對加州鱸產生的致病性與胞外蛋白酶的產生密切相關。

3.3 嗜水氣單胞菌的耐藥性及其中草藥控制

不同分離源的嗜水氣單胞菌對抗生素的耐藥性往往存在差異。夏飛等[24]分離的團頭魴致病性嗜水氣單胞菌對青霉素、阿莫西林、四環素耐藥；鄧國成等[3]分離的草魚致病性嗜水氣單胞菌對青霉素、阿莫西林也耐藥，但對四環素卻高度敏感。本實驗分離的嗜水氣單胞菌LY4除了對青霉素、阿莫西林、四環素耐藥外，對多西環素這一水產養殖允許使用的抗生素也產生了耐藥性。出現這些耐藥性差異的原因可能是由于不同養殖地區、不同養殖環境中的菌株因接觸不同的藥物環境而產生耐藥性變異[25]。

中草藥因其來源廣泛、安全性高、毒副作用小、抗耐藥機制多樣等優點，逐漸成為解決病原菌耐藥性的新途徑[26]。本實驗發現五倍子、烏梅、地榆等中草藥水提取液對嗜水氣單胞菌LY4具有良好的抑菌效果，這與羅新等[27]、彭金菊等[28]、陳霞等[29]的研究觀點相同。究其原因，可能與五倍子和地榆含有鞣質、烏梅含有有機酸等抗菌物質有關[30-32]。然而，本實驗中五倍子、烏梅等中草藥水提取液對嗜水氣單胞菌LY4的MIC分別為7.81 mg/mL和15.63 mg/mL，而羅新等[27]、彭金菊等[28]實驗表明烏梅水提取液和五倍子水提取液對嗜水氣單胞菌的MIC分別為1 000 mg/mL和1.563 mg/mL，表現出抑菌效果的差異性，可能與菌株差異、中草藥的采集地、采摘季節、煎煮方法等條件有關[33]。因此，在使用中草藥控制加州鱸出血病嗜水氣單胞菌時，應把握用藥量，注意選擇加工方法[34]。