鈍藥野木瓜中三萜類化合物分離及其含量測定

胡冬群 王霞 危英 伍慶 李亞楠 趙強(qiáng) 杜江

【摘 要】 目的： 研究民族藥鈍藥野木瓜中三萜類化合物分離及其含量測定。方法：采用多種層析技術(shù)進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)、波譜數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)對照確定化合物結(jié)構(gòu)；建立HPLC法同時(shí)測定鈍藥野木瓜中羽扇豆醇和羽扇豆酮含量的方法。結(jié)果：從鈍藥野木瓜藤莖的乙酸乙酯提取物中分離得到4個(gè)化合物，分別鑒定為羽扇豆酮（1），羽扇豆醇（2），3β-乙酰基齊墩果酸（3）和齊墩果酸（4）；其中羽扇豆醇和羽扇豆酮分別在0.5172～12.93 μg（r=0.9995）和0.945～ 23.625 μg（r=0.9992）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為97.4%和96.3%，RSD為2.4%和1.6%。結(jié)論：化合物 1～4為首次從鈍藥野木瓜中分離得到；貴州省8個(gè)不同產(chǎn)地、10批次的鈍藥野木瓜藥材中，丹寨和貴定地區(qū)樣品中羽扇豆醇和羽扇豆酮的含量最高，分別為0.0113 mg/g和0.0708 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為鈍藥野木瓜藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和相關(guān)研究與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 鈍藥野木瓜；三萜；化學(xué)成分；含量測定

【中圖分類號】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）04-0009-05

Abstract：Objective To investigate and quantitative analysis of triterpenes from Stauntonia leucantha Dieles. Methods Different chromatographic techniques were applied to separate and purify the compounds. On the basis of physicochemical properties and spectral data， their structures were identified. HPLC was performed to analysis of lupeol and lupeone in S.leucantha Diels. Results Four known compounds were isolated and identified as lupeone （1） ， 3β-O-acetyloleanolic acid （2） ， lupeol （3） and oleanolic acid （4） from ethyl acetate extract. HPLC results showed that the linear ranges of lupeol and lupeone were 0.5172～12.93 μg （r=0.9995） and 0.945～23.625 μg （r=0.9992）， the average recoveries of two ingredients were 97.4% and 96.3% as well as RSD is 2.4% and 1.6%， respectively. Conclusion Compounds 1～4 were isolated from this plant for the first time. The highest contents samples which were collected from Danzai and Guiding areas among ten samples came from eight different areas in Guizhou province， contained lupeol and lupeone were 0.0113 mg/g and 0.0708 mg/g， respectively. This results could give a scientific basis for further development and utilization of medicinal S. leucantha Diels .

Keywords：Stauntonia leucantha Diels； Triterpenoid； Chemical constituents； Content determination.

鈍藥野木瓜（Stauntonia leucantha Diels ex Y.C.）屬于木通科野木瓜屬植物，俗稱繞繞藤、五葉木通、八月瓜，主要分布在貴州、四川、安徽、江浙和兩廣一帶，具有祛風(fēng)止痛，利尿消腫的功效，對風(fēng)濕痹通、小便不利和水腫療效顯著[1]。該藥材被2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載，作為野木瓜藤入藥，但僅有性狀描述[2]。在長期研究抗病毒中藥和民族藥的過程中，采用HIV-1蛋白酶和HPLC法[3]，發(fā)現(xiàn)鈍藥野木瓜95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物在100 μg/mL時(shí)，對HIV蛋白酶的抑制率達(dá)44.3%，進(jìn)一步的文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，鈍藥野木瓜化學(xué)成分及含量研究未見報(bào)道。2015 版《中國藥典》同屬植物野木瓜（S.chinensis DC）以苯乙醇苷類成分荷苞花苷B作為指標(biāo)性成分進(jìn)行質(zhì)量控制[4]。本課題組參照藥典方法對黔產(chǎn)10批次的鈍藥野木瓜藥材中荷苞花苷B進(jìn)行定性和定量研究，發(fā)現(xiàn)含量為5.91～39.39 μg/g，荷苞花苷B需低溫存放，長時(shí)間暴露在空氣中，含量有所下降，其標(biāo)準(zhǔn)品溶液低溫存放超過24h后，易產(chǎn)生雜質(zhì)峰[5]。一些學(xué)者對野木瓜（S.chinensis DC）中的木犀草素、綠原酸、齊墩果酸和熊果酸的含量進(jìn)行了報(bào)道[6-8]，而同屬植物化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)野木瓜（S.chinensis DC）[9]、六葉野木瓜（S.hexaphylla Thunb.Dence.）、五指那藤（S.obovatifoliola subsp.intermedia）、尾葉那藤（S.obovatifoliolasp.urophylla）和黃臘果（S.brachyanthera）藤莖中常分離出羽扇豆醇和羽扇豆酮等多種羽扇豆烷型化合物[9-11]。體內(nèi)外研究證實(shí)，羽扇豆醇具抗炎、抗瘧疾、抗癌等作用[12]。羽扇豆酮對單純皰疹病毒（HSV）和非洲豬瘟病毒（ASFV）具有抗病毒活性，對HSV-1和HSV-2具有很強(qiáng)的抗病毒抑癍作用[13]。為明確鈍藥野木瓜藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)開展了鈍藥野木瓜化學(xué)成分研究，建立HPLC法同時(shí)測定羽扇豆醇和羽扇豆酮的定量分析方法，為該藥材的監(jiān)督、質(zhì)控和相關(guān)藥品、保健品的開發(fā)研制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Bruker AM-400和500 MHz核磁共振波譜儀（TMS為內(nèi)標(biāo)）；GC-MS 5973型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國HP公司）；1100型高效液相色譜儀（ 美國 Agilent）；梅特勒-托利多超聲波清洗器（METILER-TOULEDO）；ME104 電子分析天平（瑞士梅特勒）；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士布奇公司）；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵（上海予英儀器有限公司）；ZF-1三用紫外分析儀（上海電光分析）。

1.2 材料 TLC和柱色譜硅膠分別為GF254和200-300目硅膠 （青島海洋化工廠分廠）；反相硅膠為ODS DM 1020T （日本富士硅膠公司）；Sephadex LH-20 （GE 公司）。羽扇豆醇、羽扇豆烷均來自為本植物（乙酸乙酯萃取）分離純化所得，結(jié)構(gòu)經(jīng)波譜學(xué)（ESI-MS，1H-NMR，13C-NMR）分析鑒定，以HPLC面積歸一化法測定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于96%。洗脫劑均為工業(yè)重蒸品，甲醇、乙醇、磷酸（分析純，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水（超純水）。鈍藥野木瓜藥材于2014年4月采集于貴州省遵義市，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院陳德媛教授鑒定為鈍藥野木瓜的地上部分，憑證標(biāo)本保存于貴陽中醫(yī)學(xué)院中藥化學(xué)教研室（標(biāo)本號：2014/SL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 化學(xué)成分研究

2.1.1 藥材前處理 干燥鈍藥野木瓜藤莖 3 kg，粉碎后用70%的甲醇溶液（料液比為 1∶3）加熱回流提取3次，每次1 h，合并浸提液后減壓濃縮，回收甲醇至無醇味，再用乙酸乙酯萃取，濃縮，得浸膏（45 g），經(jīng)硅膠柱（柱長×內(nèi)徑=75 cm × 5.5 cm ）色譜進(jìn)行分離。以石油醚-乙酸乙酯（40∶1 → 0∶100）進(jìn)行梯度洗脫，最后用氯仿-甲醇（1∶1）混合液及純甲醇下柱，得 35 個(gè)流份（fr.1～ 35）。

2.1.2 化合物的分離純化 在fr.3，即 石油醚-乙酸乙酯 25∶1 部分（112 mg）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇（1∶1）為洗脫劑，純化得到化合物 1（27 mg）；fr. 18，即石油醚-乙酸乙酯 20∶1～18∶1部分（106 mg）經(jīng)反相硅膠柱層析，以甲醇-水（5∶5 → 10∶0）梯度洗脫，在 8∶2 洗脫部分析出結(jié)晶，用甲醇多次洗滌結(jié)晶，石油醚-丙酮重結(jié)晶得化合物2（19 mg）；fr.26，即石油醚-乙酸乙酯（15∶1 ～ 12∶1部分（363 mg）經(jīng)硅膠柱層析分離，用石油醚-丙酮（30∶1→1∶1）梯度洗脫得到 12 個(gè)流份，其中fr.5 ～ 6經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，甲醇洗脫分離純化得到化合物 3（26.7 mg）；fr.30，即石油醚-乙酸乙酯10∶1～9∶1部分（163 mg）經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-丙酮（40∶1→1∶1）洗脫，并經(jīng)石油醚-丙酮重結(jié)晶得到化合物 4（25.2 mg）

2.1.3 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物 1 白色結(jié)晶（丙酮），mp 170～172 ℃，分子式為C30H48O； ESI-MS m/z 447 [M + 23]+；H-NMR （CDCl3， 400 MHz） 、13C-NMR （CDCl3， 100 MHz） 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14] 對照基本一致，故鑒定化合物 1 為羽扇豆酮。

化合物 2 白色針晶（石油醚-丙酮）；EI-MS m/z 488 [M]+，H-NMR （CDCl3，500 MHz）、13C-NMR （CDCl3， 125 MHz）數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物2為3β-乙酰基齊墩果酸。

化合物 3 白色針狀結(jié)晶（石油醚-醋酸乙酯）， mp 210 ～ 212 ℃，分子式為C30H50O， TLC檢識遇硫酸-甲醇溶液加熱顯紫紅色， Lieberman-Burchard反應(yīng)為陽性。EI-MS m/z 426 [M]+ ，H-NMR （CDCl3， 400 MHz） 、13C-NMR （CDCl3， 100 MHz）數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16] 對照基本一致，故鑒定化合物 3 為羽扇豆醇。

化合物 4 白色簇晶（石油醚-丙酮）；EI-MS m/z 456 [M]+，H-NMR （CDCl3， 400 MHz） 、13C-NMR （CDCl3， 100 MHz）數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物4為齊墩果酸。

2.2 羽扇豆醇與羽扇豆酮的含量測定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱為Ocean C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：100%甲醇；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量為20 μL。對照品與樣品中的羽扇豆醇和羽扇豆酮色譜峰相互分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于5000，對照品和鈍藥野木瓜樣品的HPLC色譜見圖 1。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取羽扇豆醇對照品12.930 mg和羽扇豆酮對照品23.625 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，制成濃度分別為0.5172 mg/mL和0.945 mg/mL對照品貯備液。分別精密吸取上述對照品貯備液適量，加甲醇溶解并稀釋，搖勻，制成羽扇豆醇和羽扇豆酮質(zhì)量濃度分別為0.0517 mg/mL和0.0945 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取鈍藥野木瓜干燥帶葉莖枝藥材粉末（貴州都勻，過4號篩，50℃烘干）約1.0 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，用移液管精密加入甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱重，超聲提取30 min，待冷卻后，稱重，用甲醇補(bǔ)足減量，經(jīng)4000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察 分別精密吸取上述兩種對照品貯備液1、5、10、15、20、25 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得羽扇豆醇回歸方程為 Y=20.026X-6.1885（r=0.9995，n=6），進(jìn)樣量在0.5172～12.93 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；回歸方程為羽扇豆酮Y=7.6074X+2.6331（r=0.9992，n=6），進(jìn)樣量在0.945～23.625 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖2～3。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下對照品混合溶液20 μL，按2.2.1色譜條件各連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算RSD分別為0.9%和0.3%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批鈍藥野木瓜粉末（貴州都勻，過4號篩）6份，每份1.0 g，按供試品溶液的制備方法制備溶液，取供試品溶液20 μL進(jìn)樣，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，根據(jù)峰面積代入回歸方程計(jì)算質(zhì)量，得羽扇豆醇和羽扇豆酮RSD分別為1.2%（n=6）和0.8%（n=6）。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取鈍藥野木瓜粉末（貴州都勻，過4號篩）約1.0 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，取供試品溶液20μL，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣分析，分別測定峰面積。結(jié)果羽扇豆醇和羽扇豆酮峰面積的RSD分別為2.0%和1.5%。表明12 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取鈍藥野木瓜粉末（貴州都勻，過4號篩）約0.5 g，各加入對照品適量，按2.2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別吸取20 μL進(jìn)樣分析，測定羽扇豆醇、羽扇豆酮的含量，計(jì)算加樣回收率。見表1。

2.2.9 樣品分析 取貴州省3個(gè)地區(qū)鈍藥野木瓜的莖和全株，8個(gè)地區(qū)鈍藥野木瓜的全株，打成粉末（過4號篩）精密稱定1.0 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算藥材中羽扇豆醇和羽扇豆酮的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2～3。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水3個(gè)不同比例為檢測體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰出峰較晚，甚至不出峰，而甲醇-水（98∶2）首個(gè)目標(biāo)峰出峰時(shí)間接近1 h，用乙腈替換也沒明顯改善出峰時(shí)間，而用純甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，兩個(gè)目標(biāo)峰羽扇豆醇、羽扇豆酮的出峰時(shí)間明顯縮短且分離效果好，故選擇了純甲醇作為流動(dòng)相。

3.2 樣品處理方法的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了不同溶劑（甲醇、乙醇、氯仿及氯仿-甲醇）作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇作為提取溶劑提取率相對較高，氯仿-甲醇（1∶1）及氯仿次之，乙醇作為提取溶劑時(shí)目標(biāo)峰分離效果不好，故選用甲醇作為提取溶劑，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也考察了不同濃度甲醇（100%、90%、80%、75%、65%），不同提取方法（超聲提取法、回流提取法、冷浸提取法），不同提取時(shí)間（0 min、30 min、40 min、50 min、60 min），不同料液比（15倍、25倍、35倍、45倍體積），最終確定以100%甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min，料液比為25倍時(shí)樣品提取率相對較高且操作簡便，故為最優(yōu)處理方法。

3.3 樣品含量測定 由表2可知，鈍藥野木瓜全株植物中的羽扇豆醇含量均高于純莖部位，可能該植物的葉子含有較大量的羽扇豆醇成分，而羽扇豆酮的含量受植株部位的影響較小；由表3中結(jié)果顯示，羽扇豆醇的含量受植物生長環(huán)境的影響較小，但不同產(chǎn)地還是存在差異，貴州丹寨地區(qū)的鈍藥野木瓜中羽扇豆醇含量最高，為0.0113 mg/g；羽扇豆酮的含量差異較大，植株受生長環(huán)境因素影響較大，并且貴州貴定地區(qū)的鈍藥野木瓜中羽扇豆酮與總?cè)频暮孔罡撸謩e為0.0708 mg/g和0.0794 mg/g。貴州省8個(gè)不同產(chǎn)地、10批次的藥材中，丹寨和貴定地區(qū)樣品的羽扇豆醇和羽扇豆酮含量最高，分別為0.0113 mg·g-1和0.0708 mg·g-1。

實(shí)驗(yàn)首次從鈍藥野木瓜中分離、純化和鑒定出4種五環(huán)三萜化合物，并建立HPLC法同時(shí)測定鈍藥野木瓜藥材中羽扇豆醇和羽扇豆酮的含量，分析方法簡單、可行，研究結(jié)果為鈍藥野木瓜藥材的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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