響應面法優(yōu)化白刺花總黃酮提取工藝研究

陽敬　蘭慧　左強

【摘 要】 目的：優(yōu)選白刺花中總黃酮的最佳提取工藝。方法：采用響應面分析法優(yōu)化，以總黃酮提取率為評價指標，在考察單因素試驗的基礎上，選取乙醇濃度、加液量、提取溫度和提取時間為自變量，利用Design-Expert軟件分析優(yōu)化出白刺花中總黃酮的最佳提取工藝條件。結(jié)果：優(yōu)化所得白刺花中總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度為72%，加液量為21倍，提取溫度為71℃，提取時間為133 min。結(jié)論：響應面優(yōu)化所得到的最佳提取工藝準確、穩(wěn)定，是提取白刺花中總黃酮的可行方法。

【關鍵詞】 白刺花；總黃酮；提取工藝；響應面法

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）12-0013-08

Abstract：Objective Optimize the extraction technology of total flavonoids from Sophora davidii（Franch.）Skeels. Methods Response surface models was used to optimize the extraction technology of total flavonoids from Sophora davidii（Franch.）Skeels.The total flavonoids were extracted using ultrasonic assisted ethanol extraction.On the basis of single factor， the concentration of ethanol， the amount of liquid added， the extraction temperature and the extraction time were the independentvariables.Design-Expert response surface methodology was employed for selecting the optimum extraction process by the indexes of the contents of total flavonoids from Sophora davidii（Franch.）Skeels. Results Total flavonoids from Sophora davidii（Franch.）Skeels of optimum extraction conditions were as follows，72% of the ethanol concentration，21 times of the amount of liquid added，extraction temperature of 71℃，extraction time 133min. Conclusion The extraction process obtained by response surface methodology was stable and reasonable，accurate and reliable. It was a feasible method to extract the total flavonoids from Sophora davidii（Franch.）Skeels.

Keywords：Sophora davidii（Franch.）Skeels； Total Flavonoids； Extraction Process； Response Surface Methodology

白刺花又名苦豆花、白花，為豆科小灌木植物，在南方各地的山坡、田埂及丘陵地帶均有大量分布，有的荒地上甚至成為其主要的植被分布[1]。云南多數(shù)地區(qū)有食用其花的習俗，為云南紅河州彝族、白族、苗族、哈尼族等少數(shù)民族習用[2]。白刺花具有清熱利濕、消積通便、殺蟲止癢的功效，用于腹痛腹脹、食積蟲積、痢疾；帶下陰癢；疥癩瘡癬[3]；其花有清熱解暑作用，可用于暑熱煩渴等[4]。當?shù)匕傩沼闷渑莶栾嬘茫诮抵堤巧暇哂幸欢ㄐЧ匆娢墨I報道白刺花有降血脂及降血糖的作用。白刺花含黃酮及生物堿，有抗炎、抗過敏的作用[5]。基于白刺花的各種優(yōu)勢特點，筆者欲將野生白刺花的葉、花開發(fā)為保健速溶茶，通過試驗研究，優(yōu)化出白刺花總黃酮的最佳提取方法，為白刺花保健速溶茶的開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 A580型雙光束紫外可見分光光度計（翱藝儀器有限公司） ；ML204分析天平（上海亞榮儀器有限公司）；FA2004電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司） ；101型電熱鼓風干燥箱北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司） ；HH-4 型恒溫水浴鍋（常州潤華電器有限公司） ；DLF-18型流水式中藥粉碎機（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司） ；RE-3000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮儀器有限公司） 。

1.2 材料 蘆丁對照品（批號：20160427，上海金穗生物科技有限公司） ；白刺花采自紅河州豆科小灌木植物白刺花的花；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉均為分析純，購于天津市致遠化學有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備[6] 精密稱取干燥的蘆丁對照品10 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量，至水浴鍋上微熱使蘆丁溶解，冷卻后，在甲醇至刻度，搖勻，即得每1 mL含蘆丁0.2 mg的對照品溶液。

2.1.2 測定波長的選擇 取對照品溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，再加10%Al（NO3）3 溶液1 mL搖勻，再放置6 min，加1 mol / L氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，于波長400～600 nm 范圍內(nèi)掃描，500 nm波長處有一最大吸收峰，故選擇500 nm為測定波長。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密吸取蘆丁對照品溶液0、1、2、3、4、5 mL，分別置于25 mL量瓶中，按“2.1.2”項下方法，選擇500 nm波長，用相應的試劑作空白，測定每種溶液的吸光度，以吸光度Y做橫坐標，濃度X做縱坐標，繪制標準曲線，見表1及圖1。回歸方程得Y= 21.725X -0.0012，r2=0.9998，結(jié)果顯示，蘆丁在 0.008～0.04 mg/mL內(nèi)具有良好線性關系。

2.1.4 供試品溶液的制備 將白刺花原料粉碎，過60目篩，按實驗設定的條件進行提取，提取液減壓抽濾，濾液定容，即得供試品溶液。

2.1.5 樣品中總黃酮的含量測定 精密量取2 mL供試品溶液置于25 mL容量瓶中，按“2.1.2”項方法測定吸光度，計算總黃酮提取率。

總黃酮的提取率（%）=c×V1×V3×100V2×m

式中：C 為提取總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1 為測量液定容體積，25 mL；V2為測量時量取的體積，2 mL；V3為提取液定容體積，100 mL；m為稱取樣品的質(zhì)量，5000 mg。

2.2 單因素考察

2.2.1 加液量對白刺花中總黃酮提取率的影響 固定乙醇濃度60%，提取時間1.5 h，提取溫度 80 ℃ 等實驗因素，考查5、10、15、20、25倍加液量下總黃酮的變化。由圖2可知，在加液量為20倍以前，白刺花總黃酮的提取率隨加液量倍數(shù)的增大而增大，但加液量達到20倍后，總黃酮的提取率呈下降趨勢，即20倍的加液量的提取率達到高峰，因此加液量為20倍時較為合適。20倍加液量后總黃酮提取率呈下降趨勢可能是溶劑體積較大，非黃酮類成分溶解度增大而大量溶出，從而導致白刺花的總黃酮提取率的下降。

2.2.2 提取時間對白刺花中總黃酮提取率的影響 固定加液量為20倍，乙醇濃度為 60% ，提取溫度為 80 ℃等試驗因素，考察提取時間分別為1、1.5、2、2.5、3 h時白刺花中總黃酮的提取率。由圖3可知，在提取時間為2 h 時白刺花總黃酮提取率最高，繼續(xù)延長提取時間，提取率會降低，在提取時間為3 h時提取率最低，故選提取時間為2 h為最優(yōu)提取時間。圖上還反應出提取時間太長，都會使白刺花中總黃酮被破壞，以致提取率下降。

2.2.3 乙醇濃度對白刺花中總黃酮提取率的影響 固定加液量為20倍，提取時間為2 h，提取溫度為80 ℃，考查乙醇濃度分別為40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇時白刺花中總黃酮的提取率。由圖4可知，隨著乙醇濃度加大，提取液的極性越接近提取物的極性，提取率不斷提高，當乙醇濃度為70%時，白刺花中總黃酮的提取率達到最高，70%后再增大乙醇濃度提取率將降低，是因為乙醇濃度太高，白刺花中醇溶性雜質(zhì)及色素等成分溶出增多。因此70%的乙醇濃度為最優(yōu)乙醇濃度。

2.2.4 提取溫度對白刺花中總黃酮提取率的影響 固定加液量為20倍，提取時間2 h，乙醇濃度為70%等實驗因素，考查提取溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃時白刺花中總黃酮的提取率。由圖5可知，溫度升高，提取率在增高，當溫度達到70 ℃ 時，白刺花中總黃酮提取率最高，當溫度增大到80 ℃時，總黃酮提取率有所下降，當溫度增大到90 ℃時，總黃酮提取率下降明顯。因此選擇溫度為70 ℃為白刺花總黃酮提取最優(yōu)溫度。

2.3 響應面法優(yōu)化白刺花中總黃酮提取工藝 在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇濃度（A）、加液量（B）、提取溫度（C） 和提取時間（D），利用 Design-Expert 8.0.6軟件中的 Box-Behnken 軟件優(yōu)化白刺花中總黃酮提取條件。以白刺花總黃酮提取率為響應值，進行響應面分析試驗[7-8]，以 A、B、C、D 為自變量，以總黃酮提取率為響應值（Y） 進行實驗設計，各因素水平設計見表2。白刺花Box-Behnken中心組合試驗設計和結(jié)果見表3。

采用Design-Expert 8.0.6軟件分析試驗結(jié)果，以總黃酮提取率為響應值，對實驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得回歸方程為：

Y=0.92+0.018A+0.023B+7.500E-003C+0.035D+0.021AB-2.500E-003AC+0.016AD+0.034BC+7.750E-003BD-7.500E-003CD-0.093A2-0.075B2-0.043C2-0.043D2

使用Design-Expert 8.0.6軟件回歸分析對方程及各因子進行方差分析。由表4可知，以白刺花的總黃酮提取率為響應值，回歸方程顯著性檢測 P﹤0.0001，表明所得二次方程模型極顯著，而失擬項的P值為0.9986，不顯著，R2=0.9921，表明回歸方程模型與實際實驗擬合性比較好，實驗誤差較小，說明采用響應面法優(yōu)化白刺花中總黃酮提取工藝是可行的，具有參考性[9]，其中各影響因素對白刺花總黃酮提取率的影響順序為：提取時間>加液量>乙醇濃度> 提取溫度。

表4中一次項乙醇濃度、加液量、提取時間的 P 值都小于 0.0001，說明都對白刺花總黃酮的提取率有極顯著的影響，提取溫度的P值為0.0064，小于0.01，表明其對白刺花總黃酮的提取率有高度顯著的影響； 交互項BC對白刺花總黃酮提取率的影響極顯著，AD對白刺花中總黃酮提取率的影響高度顯著，其余不顯著； 二次項 A2、B2、C2、D2均達到極顯水平說明各因素對白刺花中總黃酮的提取率存在交互影響，而不是簡單的線性關系[10]

將表3中的試驗結(jié)果進行響應面的曲面分析，在影響因素中選擇其中兩個交互的因素對白刺花中總黃酮的提取率的影響進行分析，把其他因素固定為零。根據(jù)回歸方程，考察各影響因素響應曲面的形狀，分析各因素對白刺花中總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖6～11所示。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件響應曲面優(yōu)化原理，3D曲面圖的坡度越大，說明響應值對于操作條件的改變影響越大； 反之曲面圖坡度越小，操作條件改變對響應值的影響也就越小[11-12] 。圖 6～11反映了乙醇濃度、加液量、提取溫度 和提取時間四個因素交互作用對白刺花中總黃酮提取率的影響，其中乙醇濃度及加液量（圖6）、乙醇濃度及提取時間（圖8）、提取溫度及加液量（圖9）交互作用3D曲面圖坡度較大，表明這三組對白刺花中總黃酮提取率的交互作用明顯。

通過響應面分析優(yōu)化，用Design-Expert 8. 0. 6軟件對回歸方程進行計算，得到白刺花中總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度 71.59% ，加液量為21.15倍，提取溫度為71.32 ℃，提取時間2.22 h；在此條件下模型預測總黃酮提取率為0.93118% 。考慮到在實際操作中，設備等各條件有限，對最佳工藝條件修正為：乙醇濃度 72% ，加液量為21倍，提取溫度為71 ℃，提取時間為133 min。

2.4 驗證實驗 根據(jù)所修正的條件進行了3次平行驗證試驗，結(jié)果白刺花中總黃酮的平均提取率為0.9273%，與模型相對誤差為0.42%，說明實驗結(jié)果與模型擬合較好，利用響應面優(yōu)化法優(yōu)化所得到的提取工藝參數(shù)準確可靠。

3 討論

白刺花中黃酮類化合物含量豐富，具有非常好的藥用、食用、保健作用價值和開發(fā)利用前景。本研究以干燥的白刺花的花粗粉為原料，以乙醇為提取溶劑，在單因素試驗基礎上，用 Design-Expert 8.0.4 軟件對白刺花提取工藝參數(shù)進行響應面試驗優(yōu)化。結(jié)果表明最佳的提取工藝條件為：乙醇濃度 72%，加液量為21倍，提取溫度為71 ℃，提取時間為133 min。優(yōu)化所得到的最佳提取工藝是提取白刺花中總黃酮的有效途徑，為開發(fā)保健速溶茶提供可靠的依據(jù)。

參考文獻

[1]吳榮書，袁唯，趙燕.野生白刺花的加工技術(shù)研究[J].食品科學，2000（8）：67-68.

[2][JP3]董劉宏，太志剛，楊亞濱，等.白刺花花的化學成分研究[J].華西藥學雜志，2010，25（6）：636-640.[JP]

[3]云南省食品藥品監(jiān)督管理局.云南省中藥材標準（傣族藥）[M].昆明：云南科技出版社，2007：215.

[4]貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準[S].貴陽：貴州科學技術(shù)出版社，2003：138.

[5]溫敏，馬云寶，毛曉健，等.白刺花的花中化學成分研究[J].中國藥學雜志，2010，45（19）：1451-1454.

[6]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：354-355.

[7]黃杰濤，張蓮姬.響應面法優(yōu)化金花葵多糖提取工藝[J]. 食品工業(yè)科技，2016，37（19）：217-220.

[8]趙學友. 響應面法優(yōu)化川丹參總黃酮提取工藝及其體外抗氧化活性評價[J]. 中國現(xiàn)代應用藥學，2017，34（5）：686-691.

[9]吳現(xiàn)芳，趙成愛，余梅燕，等.響應面法優(yōu)化八寶景天葉總黃酮的超聲提取工藝[J]. 食品工業(yè)科技，2013，34（1）：224-228.

[10]高義霞，景紅艷，姜祖君，等. 響應面分析法優(yōu)化乳苣總黃酮提取工藝的研究[J]. 中藥材，2010，33（4）：621-624.

[11]金銀萍，王博，劉興醫(yī)，等. Box-Behnken響應曲面法優(yōu)化五味子木脂素的提取工藝[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（22）：210-212.

[12]李娜，張彥，陳萍. Box-Behnken響應曲面法優(yōu)化鹽炙杜仲炮制工藝的研究[J].化工科技，2018，26（1）：32-35.

（收稿日期：2018-04-06 編輯：程鵬飛）