HPLC法同時測定養心氏片中9個指標性成分

陳俊 徐圣弢 呂磊 呂昉 周燕妮

【摘 要】 目的：采用高效液相色譜法同時測定養心氏片中葛根素、大豆苷、丹參素、蘆丁、延胡索乙素、淫羊藿苷、芹菜素、人參皂苷Rd、阿魏酸9個成分的含量。方法：采用Agilent Plus-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5μm），檢測波長：阿魏酸采用310 nm，其余8種成分采用254 nm，流動相為乙腈（A）和0.1%甲酸水（B），A相隨時間的變化：5%～40%（0～35 min），40%（35～45 min）；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量5 μL。結果：9個指標性成分葛根素、大豆苷、丹參素、蘆丁、延胡索乙素、淫羊藿苷、芹菜素、人參皂苷Rd、阿魏酸，在35 min內實現完全分離，線性良好（r>0.9990）。方法學驗證表明，日內日間精密度RSD<5%，加樣回收率范圍為98.91%～102.74%。結論：該方法簡便、準確、實用性強，可用于養心氏片的質量控制。

【關鍵詞】 養心氏片；高效液相色譜法；含量測定

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）06-0028-04

Abstract：Objective To determine the contents of nine marker components， including puerarin， daidzin， tanshinol， rutin， tetrahydropalmatine， icariin， apigenin， ginsenoside-Rd， ferulic acid in Yangxinsihi Tablet by high performance liquid chromatography（HPLC）. Methods The HPLC condition was as follows： column： Agilent Plus-C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； The detective wavelength was set at 310nm for ferulic acid， and 254 nm for the other eight components. Mobile phase： A was ACN， B was 0.1% formic acid aqueous solution， the gradient of A phase： 5%～40%（0～35min）， 40%（35～45min）； flow rate： 1mL/min； temperature of column： 25℃； injection volume：5μL.Results Nine marker components， including puerarin， daidzin， tanshinol， rutin， tetrahydropalmatine， icariin， apigenin， ginsenoside-Rd， ferulic acid， were separated at baseline within 35 min with good linear （r>0.9990）. The result of intra-day and inter-day precisions were at normal range （RSD<5%）. Range of the recovery was between 98.91% and 102.74%.Conclusion The method is rapid， simple，accurate which can be used to control the quality of Yangxingshi Tablet.

Keywords：Yangxinsihi Tablet； HPLC； Determination

養心氏片是由十三味中藥組成的復方制劑，處方包含黃芪、淫羊藿、黃連、炙甘草、黨參、山楂、醋延胡索、丹參、地黃、靈芝、葛根、當歸和人參。具有扶正固本、益氣活血、行脈止痛的功效，常用于氣虛血瘀型冠心病、心絞痛、心肌梗塞及合并高血脂、高血糖等癥[1-2]。養心氏片所含的活性成分如黃酮類成分葛根素、大豆苷、蘆丁、芹菜素均有明顯的擴張冠狀動脈，保護心肌缺氧性損傷的作用[3]；生物堿類成分延胡索乙素有鎮靜鎮痛的作用[4]；酚酸類成分丹參素有活血化瘀的功效[5]。

目前養心氏片的研究多為臨床應用方面的報道，與含量測定相關的研究多為其中單個成分的測定，如黃芪甲苷和葛根素的測定[6-9]，2015版《中國藥典》含量測定項下僅有黃芪甲苷的HPLC測定。單個成分的測定作為養心氏片的質量控制不夠全面。而由于組分復雜，同時測定其中的黃酮類、生物堿和酚酸類難度較大，目前亦未見相關報道。本研究采用高效液相色譜法同時測定了養心氏片中9個指標性成分，方法簡便、準確，為養心氏片的質量控制及后期的作用機制研究提供基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀（含G1379A真空脫氣機、G1311A四元泵、G1367A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測器，美國安捷倫公司）；KUDOS- SK2200H超聲發生器（上海科導超聲儀器公司）；METTLER AE240型十萬分之一電子天平（德國梅特勒公司）。

1.2 材料 葛根素（批號：110752-201615）、大豆苷（批號：111738-201603）、丹參素（批號：110855-201614）、蘆?。ㄅ枺?00080-201610）、延胡索乙素（批號：110726-201618）、淫羊藿苷（批號：110737-201516）、芹菜素（批號：111901-201603）、人參皂苷Rd（批號：111818-201603）、阿魏酸（批號：110773-201614）購自中國食品藥品檢定研究院（純度>98%）；養心氏片（批號：150406，上海醫藥集團青島國風藥業股份有限公司）；色譜級甲醇購自Burdick&Jackson;公司，色譜級乙腈購自Merck公司，色譜級甲酸購自Fluka公司，水為純化水，其余試劑為分析純。

2 方法和結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液 如表1所示，精密稱取如下樣品于2 mL 量瓶中，加入2 mL甲醇定容，作為對照品儲備液，存于4 ℃冰箱，待用。

2.1.2 標準曲線的配制 精密吸取上述對照品儲備溶液各500 μL到10 mL 量瓶中，用甲醇定容，混勻，按照1∶2∶4∶8∶16∶32比例逐級稀釋，制得標曲溶液。

2.1.3 樣品溶液的制備 取2片養心氏片樣品，剝除包衣放進研缽碾碎，精密稱取1g置25mL量瓶中，加甲醇定容，超聲30 min，補足失重，過0.22 μm微孔濾膜，制得樣品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Plus-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流速：1.0 mL/min；流動相：A乙腈- B水（含0.1%甲酸），A相隨時間的變化：5%～40%（0～35 min），40%（35～45 min）；檢測波長：254 nm、310 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：5 μL；分析時間：35 min；柱后平衡時間：10 min。混合對照品、養心氏片樣品的HPLC色譜圖如圖1所示。

2.3 線性關系考察 養心氏片中各化合物的標準曲線、線性范圍及相關系數見表2。

2.4 精密度試驗 取2.1.1項下制備的系列混合對照品溶液，在1 d內連續進樣6次以及連續3d每天進樣3次，根據所得峰面積分別考察日內和日間精密度。結果9個指標性成分的日內、日間精密度RSD均小于5%，表明該方法的精密度良好。

2.5 定量限和檢測線考察 將9個對照品溶液依次進行稀釋，以信噪比10∶1時，確定其最低定量限；以信噪比3：1時，確定其最低檢測限。9個指標性成分的最低定量限分別為5.00、5.50、8.50、8.00、6.25、8.00、5.50、6.00、5.00μg/mL；最低檢測限分別為2.50、2.75、4.25、4.00、3.13、4.00、2.25、3.00、2.50μg/mL。

2.6 穩定性實驗 取制備的養心氏片樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h測定9個成分的峰面積，考察其穩定性。結果9個成分峰面積的RSD分別為2.25%、1.23%、3.84%、4.26%、1.02%、2.52%、1.37%、1.28%、4.63%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗 精密稱取同一批次養心氏片1g，共6份，按2.1.3項下方法，分別制成樣品溶液進樣分析。結果，養心氏片中9個成分含量的RSD均小于5%，表明該方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取同一批次養心氏片0.5 g，共6份，分別加入對照品一定量 （樣品中各成分含量的100%），按2.1.3項下方法制備，進樣分析，計算回收率。9個成分的加樣回收率和RSD（n=6）分別為101.42%（RSD=1.48%）、102.74%（RSD=3.87%）、98.91%（RSD=1.67%）、199.35%（RSD=2.58%）、99.27%（RSD=3.27%）、98.59%（RSD=2.73%）、100.32%（RSD=3.42%）、102.53%（RSD=1.17%）、100.41%（RSD=3.63%），回收率結果良好。

2.9 樣品測定 養心氏片中各化合物的含量通過線性方程計算。見表3。

3 討論

在色譜柱的選擇上，考慮到待測成分較多，極性差別大，為了提高分離度，選用了250 mm長柱進行分析。由于同時測定組分較多，未能保證所有峰分離度均>1.5，其中葛根素和蘆丁分離度>1.2，考慮到兩者含量較高，為指標性成分，納入了測定項，后期考慮用MS法準確定量。

在流動相的選擇上，因各成分的參考流動相比例不同，采用了乙腈-水體系，梯度洗脫，從結果看，各成分可同時檢測，分離度良好。在水相中加入甲酸可以防止葛根素、丹參素等成分出現拖尾峰，還可以抑制樣品解離[10]。在檢測波長的選擇上，由于各成分的最大吸收波長各不相同，為了統一測定條件，并考慮到阿魏酸的特征吸收，同時選擇了254 nm和310 nm兩個波長，其中310 nm測定阿魏酸，254 nm測定其余8個成分。

由樣品測定結果可見，養心氏片中多個活性成分含量穩定，其中治療氣虛血瘀的藥如丹參、人參和葛根中所含的丹參素、人參皂苷Rd、葛根素的含量較高，符合本制劑的組方特點。本研究可同時測定養心氏片9個指標性成分的含量，方法簡單，穩定可靠，可用于養心氏片的質量控制。

參考文獻

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