胡桃楸水提取物中沒食子酸和丁香酸在大鼠血漿中的藥代動力學研究

陳晨 王添敏 邸學 康廷國

【摘 要】 目的：對大鼠口服胡桃楸水提取物后血漿中沒食子酸和丁香酸進行藥代動力學研究，初步確定其藥代動力學參數。方法：采用HPLC分析方法測定大鼠血漿中沒食子酸和丁香酸的濃度。色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×100 mm，2.7 μm），預柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×5 mm，2.7 μm）；流動相：0.2%甲酸水（v/v，A）- 0.2%甲酸乙腈（v/v，B），流速：0.3 mL/min，梯度洗脫條件為：0～3 min，0～5 % B；3～5 min，5～10 % B；5～13 min，10 % B，后運行時間為3 min，柱溫為30 ℃。單次灌胃給予大鼠胡桃楸水提取物（以生藥量計9.6 g/mL），灌胃劑量為1 mL/100 g，于給藥前和給藥后5、15、30、45、60、90、120、240、360和480 min分別取血0.2 mL，將血漿采用甲醇蛋白沉淀法處理后，取10 μL供HPLC分析。應用3P97軟件處理數據，計算其藥代動力學參數。結果：沒食子酸在0.04～5 μg/mL范圍內線性良好，最小檢測限（LOQ）為0.006 μg/mL，最小定量限（LOD）為0.04 μg/mL；日內和日間精密度（RSD）分別為1.8 %～11.0 %和3.5 %～9.4 %，準確度（RE）分別為-0.7 %～1.3 %和-0.5 %～2.1 %；血漿提取回收率為81.2 %～94.4 %；藥代動力學參數為Cmax=（0.64±0.05）μg/mL，Tmax=（61.80±8.03）min，T1/2=（184.21±12.73）min，AUC0-t=（96.37±10.33）μg·min/mL，AUC0-∞=（121.59±8.87）μg·min/mL。丁香酸在0.04～5 μg/mL范圍內線性良好，最小檢測限（LOQ）為0.008 μg/mL，最小定量限（LOD）為0.04 μg/mL；日內和日間精密度（RSD）分別為4.0 %～6.9 %和2.1 %～8.8 %，準確度（RE）分別為-1.2 %～4.9 %和-4.8 %～0.8 %；血漿提取回收率為84.9 %～93.6 %；藥代動力學參數為Cmax=（0.43±0.04）μg/mL，Tmax=（30.67±0.92）min，T1/2=（99.63±5.96）min，AUC0-t=（40.33±2.42）μg·min/mL，AUC0-∞ =（47.02±3.29）μg·min/mL。結論：研究建立大鼠血漿中沒食子酸和丁香酸濃度的高效液相色譜分析方法，經過方法學驗證，該方法靈敏度高、重現性好、專屬性強，符合生物樣品分析的要求，并成功應用于大鼠血漿中沒食子酸和丁香酸的分析。

【關鍵詞】 胡桃楸；沒食子酸；丁香酸；大鼠；藥代動力學

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）04-0028-06

Abstract：Objective Made a pharmacokinetic research of gallic acid and syringic acid in rat plasma after orally administration of the water extraction of Juglans mandshurica Maxim. to preliminary confirm parameters of pharmacokinetics. Methods Used a HPLC analytical method to test concentrations of gallic acid and syringic acid in rat plasma. Column： Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×100 mm， 2.7 μm）and Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×5 mm， 2.7 μm）； mobile phases consist of ultra pure water （A） and acetonitrile （B） both with 0.2 % （v/v） formic acid at a flow rate of 0.3 mL/min， the following gradient elution was applied： from 0 % to 5 % B between 0 and 3 min， from 5 % to 10 % B between 3 and 5 min， 10 % B between 5 and 13 min， a 3 min post run time back to the initial mobile phase composition was used after each injection， column temperature was set at 30 ℃.Blood samples （0.2 mL） were collected before dosing and 5， 15， 30， 45， 60， 90， 120， 240， 360， 480 min after single dosing （crude herbal： 9.6 g/mL）， the dose of intragastric administration was 1 mL/100 g. After pre-treatment with protein precipitation method （methyl）， 10 μL was injected into HPLC system. The pharmacokinetic parameters were calculated by 3p97. Results Gallic acid had great linear at the range of 0.04～5 μg/mL， LOQ = 0.006 μg/mL， LOD = 0.04 μg/mL； the RSDs of precision were from 1.8 % to 11.0 % for inter-day assay and from 3.5 % to 9.4 % for intra-day. The accuracy were at the range of -0.7 %～1.3 % and -0.5 %～2.1 %， respectively； the extraction recoveries were from 81.2 % to 94.4 %； Cmax and Tmax were （0.64±0.05 μ）g/mL and （61.8±8.03）min， T1/2 were （184.21±12.73）min， AUC0-t and AUC0-∞ were （96.37±10.33）μg·min/mL and （121.59±8.87）μg@min/mL. Springic acid had great linear at the range of 0.04～5 μg/mL， LOQ = 0.008 μg/mL， LOD = 0.04 μg/mL； the RSDs of precision were from 4.0 to 6.9 % for inter-day assay and from 2.1 % to 8.8 % for intra-day. The accuracy were at the range of -1.2 %～4.9 % and -4.8 %～0.8 %， respectively； the extraction recoveries were from 84.9 % to 93.6 % ； Cmax and Tmax were （0.43±0.04）μg/mL and （30.67±0.92）min， T1/2 were （184.21±14.73）min， AUC0-t and AUC0-∞ were （40.33±2.42）μg·min/mL and （47.02±3.29）μg·min/mL. Conclusion The described HPLC method， with acceptable accuracy， which met all requirements in bioanalysis and was applied to analyze gallic acid and syringic acid in rat plasma successfully.

Keywords：Juglans mandshurica Maxim.； Gallic acid； Syringic acid； Rat； Pharmacokinetics

胡桃楸又名山核桃、核桃楸，為胡桃科胡桃屬植物Juglans mandshurica Maxim.，分布于我國東北、華北以及朝鮮、日本等地區[1-2]。胡桃楸與同屬植物胡桃（J. regic L.）功效類似，胡桃始載于宋代《開寶本草》，具有鎮痛、清熱解毒之功效。研究表明，胡桃楸具有防護電離輻射[3]、抗氧化[4]和抗腫瘤[5]等藥理作用。據WHO預測，全球癌癥病例到2035年將達到2400萬人[6]，癌癥已經成為威脅人類健康的重要因素。如何有效控制、治療癌癥受到全世界的關注。胡桃楸的水煎液在民間即用于治療肝癌和胃癌[7-8]等。目前，越來越多的學者關注胡桃楸的抗腫瘤作用，據報道胡桃楸莖枝和樹皮等均具有抗腫瘤的作用[9-10]。本課題組研究表明胡桃楸不同部位的水提取和乙醇提取物具有一定的抗腫瘤作用[11-12]。由于胡桃楸抗腫瘤功效較好，關于其研究越來越多，研究方向多集中在化學成分分析[13-14]和體外抗腫瘤活性研究（Hela、PC-3、SMMC-7721、MCF-7和A549）[15-16]等方面。關于胡桃楸水提取物的體內藥代動力學研究未見相關文獻報道。筆者應用HPLC 分析方法研究胡桃楸水提取物中主要成分沒食子酸和丁香酸在大鼠體內的藥代動力學參數，為胡桃楸的深入研究和開發奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 試劑與材料 胡桃楸莖枝于2016年4月6日在遼寧省大連市普蘭店蓮山鎮采摘，并由遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為胡桃科植物胡桃楸（Juglans mandshurica Maxim.），憑證標本編號為ZHI20160406，保存于遼寧中醫藥大學中藥鑒定研究室。沒食子酸（Gallic acid）、丁香酸（Syringic acid）和咖啡酸（Caffeic acid）均購于Sigma-Aldrich （上海），純度均>98 %；乙腈購于默克公司（達姆施塔特，德國）；維生素C、甲醇購買于科密歐化學試劑有限公司（天津）；純凈水購于大連娃哈哈飲用水有限公司（大連，遼寧）。乙腈和甲醇均為色譜級試劑，甲醇和純凈水在使用前均經過0.45 μm微孔濾膜濾過。

1.2 儀器 安捷倫1260高效液相色譜儀（安捷倫公司）；FD-1A-50冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）；QF-3800氮氣吹干儀（天津市旗美科技有限公司）；H1650-W臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；SY-2000旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-DIII循環水真空泵（河南予華儀器有限責任公司；JA21002精密電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；ALC-110.4電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；CP225D電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.3 動物 SPF級SD大鼠，雄性，體重為（200±20）g，購于遼寧長生生物技術有限公司，實驗動物合格證號為SCXK（遼）2015-0003。

2 方法

2.1 胡桃楸水提取物的制備 將胡桃楸莖枝切成厚度為5 mm的飲片，冷凍干燥；稱取200 g凍干飲片，置于5000 mL圓底燒瓶中，加入2000 mL純凈水，浸泡2 h，回流提取2 h，濾過，殘渣用適量純凈水潤洗后，繼續加入1600 mL純凈水回流提取2次，每次2 h。合并所有水提取液和潤洗液，濾過，采用旋轉蒸發儀（60℃）減壓濃縮至50 mL。濃縮液冷凍干燥48 h（-50 ℃，10 pa），得胡桃楸水提取物凍干粉25 g。實驗前，稱取凍干粉18 g加入15 mL純凈水，混勻，即為用于大鼠口服給藥的胡桃楸水提取物，以生藥計濃度為9.6 g/mL。經HPLC測定胡桃楸水提取物中沒食子酸和丁香酸的含量分別為19.38 %和1.05 %。

2.2 色譜條件 采用Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×100 mm，2.7 μm）色譜柱和Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×5 mm，2.7 μm）預柱（安捷倫）對待測物（沒食子酸、丁香酸）和內標物（咖啡酸）進行梯度洗脫分析。流動相為0.2 %甲酸水（A）-0.2 %甲酸乙腈（B），梯度洗脫條件為：0～3 min，0～5 % B；3～5 min，5 %～10 % B；5～13 min，10 % B，后運行時間為3 min，柱溫設定為30 ℃，流速為0.3 mL/min，進樣體積為10 μL。

2.3 血漿樣品處理方法 吸取100 μL血漿，分別加入10 μL內標溶液和10 μL維生素C溶液（5 mg/mL），渦旋1 min，向混合物中加入360 μL甲醇，渦旋1 min，再靜置3 min，以10，000 rpm條件下離心3 min，移取上清液于另一1.5 mL EP管內，空氣吹干溶劑，在殘渣中加入50 μL 10 %甲醇（v/v）溶液復溶，渦旋3 min，以10，000 rpm條件下離心3 min，取上清液10 μL供HPLC分析。

2.4 待測物和內標物儲備液的配制 分別精密稱取沒食子酸、丁香酸和咖啡酸對照品（圖1）適量，加入10 %甲醇溶液溶解，配置成濃度為1 mg/mL的待測物和內標物儲備液。

2.5 質控（QC）樣品的制備 取空白血漿100 μL，分別加入沒食子酸、丁香酸工作液各10 μL（濃度均為0.5、5和40 μg/mL），制備成低、中和高3個不同濃度的QC樣品。沒食子酸和丁香酸的血漿濃度均為0.05、0.5和4 μg/mL。

2.6 方法學驗證

2.6.1 專屬性 將空白血漿、加入待測物和內標物的空白血漿、胡桃楸水提取物口服給藥后的血漿，按照“血漿樣品處理方法”項下的方法處理（重復6次），對比上述三者的色譜圖，以排除待測物和內標物出峰時間內的干擾峰，考察方法的專屬性。

2.6.2 標準曲線 將沒食子和丁香酸的儲備液用10 %甲醇溶液逐級稀釋，沒食子酸和丁香酸系列工作液濃度均為0.4、1、2、5、10、20和50 μg/mL；取適量咖啡酸儲備液，用10 %甲醇溶液將濃度稀釋至5 μg/mL，即為內標溶液。取100 μL 空白血漿，分別加入沒食子酸、丁香酸系列工作液各10 μL，配置成相當于沒食子酸和丁香酸的血漿濃度為0.04、0.1、0.2、0.5、1、2和5 μg/mL的血漿樣品，按照“血漿樣品處理方法”項下的步驟操作后，取10 μL供HPLC分析，以1/C2作為權重系數，以相對峰面積對血漿濃度進行線性回歸，得到標準曲線和相關系數。

2.6.3 準確度、精密度 取低、中和高3個濃度的QC樣品，按照“血漿樣品處理方法”項下方法處理，每個濃度重復6次，連續測定3 d。根據隨行標準曲線計算血漿濃度，計算同一濃度QC樣品的RSD和RE，考察方法的日內精密度和準確度，連續計算3 d，考察方法的日間精密度和準確度。

2.6.4 提取回收率 取低、中和高3個濃度的QC樣品，按照“血漿樣品處理方法”項下的方法處理后進樣分析，每個濃度重復6次。記錄沒食子酸、丁香酸和咖啡酸的峰面積（A1）；另取空白血漿樣品，除不加內標溶液，其余按照“血漿樣品處理方法”項下的方法操作，蛋白沉淀后的上清液中加入上述相應等濃度的沒食子酸和丁香酸工作液10 μL、內標溶液10 μL，然后同法操作，記錄沒食子酸、丁香酸和咖啡酸的峰面積（A2）。以峰面積的比值A1/ A2計算提取回收率。

2.6.5 穩定性 取低、中和高3個濃度的QC樣品，按照“血漿樣品處理方法”項下方法處理血漿樣品，每個樣品重復3次。考察含藥血漿樣品處理后室溫放置3 h、含藥血漿-20℃放置14 d和含藥血漿樣品-20℃至室溫反復凍融循環3次的穩定性。

2.7 藥代動力學研究 取6只SD大鼠，在動物房適應性飼養7 d，口服給藥前12 h禁食，自由飲水。胡桃楸水提取物的口服給藥量為12 g/kg（給藥體積為1 mL/100g）， 于給藥前及給藥后5、15、30、45、60、90、120、240、360和480 min眼底靜脈叢取血約0.2 mL，置于肝素化1.5 mL離心管，10，000 rpm離心3 min，上清液即為血漿樣品。另取1.5 mL離心管，加入100 μL血漿樣品，按照“血漿樣品處理方法”項下方法處理血漿樣品，進行HPLC分析，測定大鼠血漿中沒食子酸、丁香酸的濃度，使用Excle軟件繪制血漿濃度-時間曲線，應用藥代動力學處理軟件3p97按二室模型計算主要的藥代動力學參數。

3 結果

3.1 HPLC分析方法建立和驗證

3.1.1 專屬性 比較空白血漿、加入待測物和內標物的空白血漿和口服給藥后血漿的色譜圖，如圖2顯示，在沒食子酸（4.21 min）、丁香酸（11.82 min）和咖啡酸（9.66 min）的保留時間內，無雜質峰干擾，待測物和內標物之間互不干擾。

3.1.2 線性關系 加入沒食子酸和丁香酸系列工作液的血漿樣品，按照“血漿處理方法”項下步驟處理后，供HPLC分析，以1/C2作為權重系數由SPSS軟件擬合出沒食子酸和丁香酸線性回歸曲線方程、相關系數以及線性范圍均列于表1。最小定量限為0.04 μg/mL（信噪比為10）。其中，y定義為各待測物與內標物峰面積比值，x定義為血漿濃度。

3.1.3 精密度與準確度 由表2可知，沒食子酸、丁香酸的日內、日間精密度和準確度均符合生物分析方法的要求，表明分析方法穩定可行。

3.1.4 回收率 由表3可知，沒食子酸和丁香酸低、中、高3個濃度的提取回收率均在81.2 %～94.4 %之間，RSD在9.1 %以內，因此該血漿處理方法對2個待測物基本適用。

3.1.5 穩定性 由表4可知，沒食子酸和丁香酸低、中、高3個不同濃度QC樣品在室溫放置3 h、冷凍2周和3個凍融循環后，待測物濃度沒有明顯變化，穩定性良好。

3.2 大鼠藥動學研究 大鼠口服給藥后，沒食子酸和丁香酸血漿濃度-時間曲線如圖3所示，藥代動力學參數詳見表5。

4 討論

在血漿樣品處理方法建立過程中，考察了不同提取條件，如：乙腈和甲醇分別作為沉淀劑、乙酸乙酯提取和正丁醇提取，每個提取方法考察了不同的酸化條件，包括酸的種類、濃度和加入體積。結果表明，加入10 μL 維生素C溶液（5 mg/mL），以甲醇作為蛋白沉淀劑的提取回收率高，重復性好，無內源性雜質干擾。

選擇內標物時，應主要考慮以下因素：內標物的化學性質穩定，不與內源性物質和待測物反應；內標物要與待測物的化學結構相似；出峰時間與待測物相近。本研究考察了咖啡酸、香草酸和芥子酸，綜合上述標準，最終選擇咖啡酸作為內標物。

沒食子酸的藥代動力學參數如下：Cmax=（0.64±0.05）μg/mL，Tmax=（61.80±8.03）min，T1/2=（184.21±12.73）min，AUC0-t=（96.37±10.33）μg·min/mL，AUC0-∞=（121.59±8.87）μg·min/mL；丁香酸的藥代動力學參數如下：Cmax=（0.43±0.04）μg/mL，Tmax=（30.67±0.92）min，T1/2=（99.63±5.96）min，AUC0-t=（40.33±2.42）μg·min/mL，AUC0-∞=（47.02±3.29）μg·min/mL。以上沒食子酸和丁香酸在大鼠體內的藥代動力學參數與已發表文獻[17-18]中不同，可能是因為胡桃楸水提取物中其他成分對其產生影響，需進一步研究。

研究表明沒食子酸和丁香酸廣泛存在于胡桃楸的不同部位，并且可以分別抑制人神經母細胞瘤SK-N-SH [19]和人乳腺癌細胞MDA-MB-231[20]等腫瘤細胞的增長。同時，胡桃楸不同部位的水提取物和乙醇提取物均具有不同程度的抗腫瘤作用，因此沒食子酸和丁香酸可能是抗腫瘤的活性成分[11-12]。

經過方法學驗證，此HPLC分析方法適用于分析血漿樣品中沒食子酸和丁香酸的含量，且靈敏度高，重現性好，精密度和準確度均符合生物樣品分析的要求。胡桃楸水提取物中沒食子酸和丁香酸的藥代動力學研究為胡桃楸的深入研究和開發奠定基礎。

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