鱸魚核型、Ag-NORs和C-帶分析

王曉艷，王世鋒，張建設，陳 治，吳常文，高天翔

（1.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，國家海洋設施養殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022；2.海南大學熱帶生物資源可持續利用省部共建國家重點實驗室培育基地，海南海口 570228；3.中國海洋大學水產學院漁業生態學實驗室，山東青島 266003）

鮨科包括約62屬449個種類[1]，多數種類是重要的經濟品種。鱸Lateolabrax japonicus，俗稱花鱸，體側有若干黑色斑點。為鱸形目Perciformes鮨科Serranidae鱸屬Lateolabrax，是近岸淺海中下層魚類，喜棲息于河口咸淡水交界處，肉食性，耐寒性較一般溫水魚強，水溫14℃以上時攝食[2]。

染色體是基因的載體。染色體研究可通過研究現有物種在染色體結構上的差異來追溯其染色體進化，進而了解染色體結構改變在物種進化分歧中的作用。魚類在漫長的進化過程中，形成了繁多的演化分枝，物種進化異常活躍。王世鋒[3]認為魚類外部形態特征在不同環境或生理條件上常會發生顯著變化，所以傳統的形態學鑒定并不能得到準確的分類。DE-AGUILAR，et al[4]提出鑒于細胞遺傳學可以揭示在形態學水平上不能體現的種屬間相似性和差異性，可能在進化分析方面起到重要作用。而到目前為止，絕大多數魚類的染色體研究局限于最基礎的層次——核型的研究，僅對魚類基因組中染色體的數目和形態進行描述。本研究采用采用胸腔活體注射PHA及秋水仙素溶液，取鱸魚頭腎細胞進行低滲處理，空氣干燥法制片。并對其進行Giemsa染色分析其核型，硝酸銀染色研究其核仁組織區（NORs），Ba（OH）2處理研究其異染色質（C-帶），并對鮨科魚類核型研究情況作了統計和分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鱸魚4尾，性腺未成熟個體3尾，雌性個體1尾，購自浙江省舟山市普陀東方水產養殖開發有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 染色體標本制備[2]

參照王德祥等[5]的方法稍作修改。樣品個體按1 mL/100 g魚體重于尾靜脈抽血，胸腔注射植物血凝素（PHA）（20血，胸-6g/g[3]魚體重），3.5 h后以3以5A-6g/g魚體重注射秋水仙堿，15 min后剪鰓放血取頭腎。在0.85%生理鹽水中將頭腎剪碎，靜置，取上層細胞懸液1 000 r/min離心，收集的頭腎細胞重懸于0.075 mol/L的KCl溶液中，37℃低滲30 min。1 000 r/min離心收集細胞后用卡諾氏固定液（甲醇:冰乙酸=3:1，V/V）進行固定，連續固定3次，空氣干燥法制片。

1.2.2 核型分析

制備的染色體標本經10%Giemsa染色20 min，蒸餾水沖洗，自然晾干后進行顯微觀察和拍照。選擇分散良好、形態清晰、兩條臂適當分開且數目完整的中期分裂相約100個進行拍照。進行染色體計數、測量，并根據LEVAN，et al[6]的分類標準進行染色體配對、分組，其中染色體相對長度=（每一染色體長度/單套染色體組總長度）套染色體，臂比=長臂/短臂。

1.2.3 Ag-NORs（銀染核仁組織區）

按照HOWELL，et al[7]的方法略加修改。50%硝酸銀與20%明膠顯影液（內含1%甲酸，V/V）按2:1（V/V）混勻后加于新制備1～2 d的標本上，加蓋蓋玻片，60℃溫浴至標本呈金褐色時迅速用蒸餾水沖洗以移除蓋玻片及殘留試劑，晾干后即可用于觀察，拍照。

1.2.4 C-帶

參照SUMNER[8]的方法略作修改。將老化1～2周的染色體標本，在0.2 mol/L HCl中處理30 min，漂洗晾干，置預熱至50℃的1%氫氧化鋇溶液中處理10～16 s，蒸餾水漂洗晾干，然后在62℃預熱的2×SSC中溫浴2 h后漂洗晾干，最后用10%Giemsa染色20 min，雙蒸水漂洗，晾干后即可用于觀察和拍照。

2 試驗結果及分析

2.1 染色體核型分析

對鱸魚92個分散良好的染色體中期分裂相進行觀察計數，觀察結果見表1。由表1可見鱸魚中期分裂相染色體總數為48的有83個，占分裂相總數的86.46%，由此可以判斷，鱸魚的二倍體染色體總數為48。表2中各染色體的相對長度是從10個良好中期分裂相中所得數據的均值，最長染色體為5.25，最短染色體為2.41，長度比為2.18，染色體相對長度順次減少。第12對染色體具次縊痕，最易辨認，其余各相鄰染色體對間長度差異不明顯，未發現異型性染色體。通過核型分析（表2可知鱸魚染色體核型為2n=48=48t，FN=48。鱸魚染色體的中期分裂相和核型圖，如圖1所示。

2.2 Ag-NORs

在所觀察的近200個中期分裂相中，發現鱸魚的Ag-NORs具有數目多態性和形態多態性（圖2）。其中數目多態性表現為：位于第12對同源染色體次縊痕處的Ag-NORs穩定存在于每個中期分裂相中（圖2a）；第1對同源染色體其中1條染色體在部分中期分裂相中被銀染；甚至在部分分裂相中，幾乎所有染色體均能被不同程度銀染，這種現象尚未見報道（圖2b）。形態多態性主要表現為第12對染色體Ag-NORs大小及銀染強度。而在間期細胞中，出現1個和2個銀染位點的間期細胞最多，同時又有眾多位點被銀染的現象，如圖3所示。

表1 鱸魚染色體數目統計Tab.1 Chromosome numbers of L.japonicus

表2 鱸魚染色體相對長度及臂比Tab.2 The relative length and ratio of chromosome in L.japonicus

圖1 鱸魚染色體中期分裂相及核型Fig.1 The chromosome metaphase and karyotype of L.japonicus

2.3 C-帶

鱸魚大部分染色體具有微弱的C-帶，主要位于染色體著絲點位置。其中第1對染色體靠近著絲點位置具有明顯C-帶，部分染色體具有不穩定的居間C-帶。第12對染色體次縊痕處為C-帶陰性（圖 4）。

3 討論

迄今為止，已有35種鮨科魚類進行過核型研究（表3），大多只進行了簡單的核型分析，帶型研究尚不多見，見表3。

在所統計的35種鮨科魚類二倍體染色體數均為48（2n=48），半數以上（19/35）為端部著絲粒染色體，而48條端部著絲粒染色體被認為是魚類的原始核型[4]。鮨科魚類的染色體核型結構具有很強的趨同性和保守性，種類繁多的鮨科魚類的形成可能是在魚類進化過程中，染色體不斷重組和積累所造成的。鮨科魚類染色體臂數從48到96不等，其中4種魚類中出現了中部著絲粒染色體，如Centropristis ocyurus、Diplectrum eumelum、E.ftrio和E.merrt，這可能是由臂間倒位引起。18種魚被報道有次縊痕，而次縊痕位置有所不同，如S.fltviventris、Ptrtcentropristis hepttus、Serrtnus ctbrillt位于第1對染色體上；D.rtditle位于第3對染色體位置；Lateolabrax japonicus位于第12對位置；S.scribt位于第 16對染色體；Tlphestes tfer、E.tdscensionis、E.tlextndrinus、E.twotrt、E.ctninus、E.coioides、E.ftscittomtculosus、E.ftscittus、E.gutzt、E.mtltbtricus位于第24對染色體位置，次縊痕處為核仁組織區位置。Ag-NORs數目大多為1對處于靠近著絲粒位置，但在巖石斑魚E.tdscensionis中發現2對Ag-NORs，其中1對位于端粒位置。本文研究鱸魚的二倍體染色體數為48，第12對染色體上具次縊痕，與喻子牛等[32]的研究結果一致，銀染位點具有形態多態性和數目多態性，形態多態性表現為第12對染色體核仁組織區大小不同，銀染位點存在方式不同，數目多態性表現為中期分裂相中銀染位點的絕對數目及間期細胞核中銀染位點數目。

圖2 鱸魚的銀染中期分裂相Fig.2 The silver-staining metaphase of L.japonicus

圖3 鱸魚的銀染間期細胞核Fig.3 The silver-staining interphase nuclei of L.japonicus

圖4 鱸魚C-帶中期分裂相Fig.4 The C-banding metaphase of L.japonicus

表3 鮨科魚類染色體概況Tab.3 Review of the chromosome data in the family Serranidae

Ag-NORs表現為C帶陽性（異染色質）這種現象在很多研究中均有報道，如鮨科的E.tlextndrinus、E.gutzt、點帶石斑魚 E.gtltbtricus、黑點副鋸鮨 Ptrtcentropristis hepttus、九帶鮨 Serrtnus ctbrillt、紋首鮨 S.scribt。但鱸魚的Ag-NORs為C帶陰性，而在第1對染色體靠近著絲粒位置卻發現了明顯的居間異染色質帶，DE-AGUILAR，et al[4]在對5種鮨科魚類細胞遺傳學研究中發現輻狀沙鮨D.radiale也具有相似的現象，認為這是由于NORs（核仁組織區）易位到其它染色體上，從而導致居間異染色質與NORs不在同一位置。

在染色體進化方面，MARTíNEZ，et al[15]對鮨科5種魚類進行了C帶研究，結果發現所研究的5種魚類異染色質含量有減少的傾向，并認為這與魚類的進化方向一致，即通過丟失異染色質區域中多余的DNA，朝較小的基因組和更特化的方向進化，同時染色體重組方式也導致了異染色質的重新分布。鱸魚染色體表現為微弱的異染色質帶，且并不是每條染色體均存在異染色質帶，說明鱸魚是該科魚類中較特化的種類。

在鱸魚染色體銀染研究中還發現了非常有趣的現象，即眾多銀染位點的出現（某些中期分裂相中幾乎每個染色體均表現為不同程度的銀染陽性），這種現象在鮨科和石首魚科的研究中都未發現，而在一種鼻涕蟲Milax nigricans的研究中發現了類似現象[38]。本次研究進行了多次重復試驗，可以排除試驗誤差，仍發現有相似現象出現，而且在經過C帶處理后也沒有對銀染位點造成顯著的減少，在標本放置兩個多月后進行銀染，多銀染位點現象仍然出現。其出現的原因可能是：（1）具翻譯活性的rDNA存在于每條染色體上，但在染色體中期這種活性大多會消失，而僅在某些特定染色體的核仁組織區顯示為銀染活性。這可以從間期細胞核中眾多銀染位點的存在得到佐證，但究竟是什么起到調控作用尚待進一步研究；（2）染色體進化過程中頻繁的易位所造成。