刺參神經肽S受體基因的克隆及表達

宋伊敏，楊靜文，閆允君，平洪領,2，王天明

（1.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，國家海洋設施養殖工程與技術研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，浙江舟山 316021）

神經肽S（neuropeptide S，NPS）是于2002年發現的一種活性肽，利用反向藥理學證明它是GPR154（G-protein coupled receptor 154，其功能與哮喘、過敏、焦慮及炎癥反應相關）的內源性配體[1]，后經XU Yanling，et al[2]對其進一步研究將其命名為神經肽S。NPS作為一類肽類神經遞質，由20個氨基酸組成，通過激活其受體（NPSreceptor，NPSR）介導下游信號轉導[3]。NPSR是一種G蛋白偶聯受體（GPCR），主要結合Gs和Gq蛋白；NPS與NPSR結合后，可引起細胞內Ca2+瞬時增加，也可使cAMP水平提高[2]，此外，還能激活MAPK信號通路從而激活細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein，ERK1/2）[4-5]，介導細胞內下游信號的傳遞。NPSR與其他多肽受體有中等程度的同源性，尤其是血管加壓素（vasopressin/oxytocintype，VP/OT-type）受體，但也僅僅有 21%～23%的氨基酸殘基相同[6]。XU Yanling，et al[2]發現，NPS 前體肽mRNA在大鼠的腦、甲狀腺、唾液腺、乳腺、脊髓、眼、舌、心、肺、小腸、睪丸、食管等多種組織中均有表達，在腦、甲狀腺、唾液腺和乳腺表達水平最高，在外周組織有少量分布，而其受體NPSR mRNA則高表達于神經系統內，如運動皮質、前嗅核、梨狀皮質、丘腦、下丘腦、杏仁核等，同時在外周組織中亦有廣泛表達[7-8]。

NPSR已在人、兔、家豬等高等動物中得到克隆，且生理功能的研究主要集中于大鼠、小鼠等高等模式動物[9-10]，在低等動物中的相關研究較少。目前研究表明，NPS系統在抗焦慮恐懼[11]，調節動物的覺醒與睡眠[2]，調節小鼠恐懼記憶[12-13]，影響攝食行為[14-16]，調節和參與成癮過程[17-18]等諸多生理功能方面都有作用。先前的研究認為NPS及其受體僅存在于四足動物中（包括哺乳動物、鳥類、爬行動物和兩棲動物），然而后續更廣泛的系統發育分析顯示，NPSR同源蛋白也存在于無脊椎動物中。例如，在果蠅Drosophila sp和其他昆蟲中，NPS/NPSR同源基因編碼的蛋白主要參與控制其蛻皮過程，被稱為甲殼類心動肽（crustacean cardioactive peptide，CCAP）及其受體（crustacean cardioactive peptide receptor，CCAPR）[19-20]。因后口無脊椎動物中，NPS的同源肽在N端有著共同的Asn-Gly（NG）基序，也被統稱為NG肽。由于NPS/NPSR基因在進化中出現較晚，且NPS系統廣泛分布于中樞神經系統及外周組織，執行眾多生理功能，因此還需要大量的工作來探究其功能特征。

刺參Apostichopus japonicus隸屬于棘皮動物門Echinodermata、海參綱Holothuroidea、楯手目Aspidochirota、刺參科Stichopodidae[21]，是中國北方重要的海水養殖種類，營養價值高且藥用價值廣泛。海參在水溫上升至20℃以上會向深水移動，藏于巖石下，不動不食，進入“夏眠”[22]。在此期間，刺參停止攝食，基礎代謝下降，消化道退化，體重減輕[23]。刺參夏眠期間，機體消耗自身組織維持基本的能量需求，體質量下降30%～50%，從而嚴重影響其養殖產量[24-25]。刺參的夏眠涉及到復雜的生理過程，目前對其發生機理及調控研究不斷深入，隨著刺參全基因組數據的發布，大量基礎序列信息為刺參生物學研究提供極大支持[26]；從神經內分泌調控角度出發，探討相關神經激素及遞質系統在夏眠等生理過程中的作用機制，將有助于進一步闡明刺參的夏眠機制。

本研究克隆了刺參NPSR-like基因（AjNPSR-like）的全長cDNA序列，利用生物信息學和細胞生物學的方法對AjNPSR-like的受體結構特點進行了預測鑒定，分析了GFP融合表達蛋白AjNPSR-like-EGFP的亞細胞定位特征，檢測了其在刺參各個組織和時期的表達情況。為進一步研究NPS/NPSR系統在刺參夏眠期間攝食、代謝調控中的作用機制以及在無脊椎動物中的生理調控作用及進化演變提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用非夏眠刺參于2016年4月取自山東青島刺參膠南養殖場，采捕刺參時池內水溫為12.35°C，體質量為（79.7±4.7）g；低溫運輸至實驗室，暫養馴化 1 周，池內水溫控制在（16±0.5）°C，鹽度為 31.0±0.5，24 h不間斷充氣，每日按時投喂人工配合飼料；活體解剖獲取刺參組織（呼吸樹、消化道、體壁、肌肉、神經環），液氮冷凍保存。非夏眠刺參取樣后，剩余刺參一直飼養至2016年9月，不控溫自然升至25°C以上，解剖觀察消化道退化成直徑約1 mm的細線[27]，采集各組織樣品后液氮冷凍保存。

實驗主要采用試劑為 Trizol（Invitrogen）、三氯甲烷（國藥），異丙醇（國藥）、DEPC水（碧云天），RQ1RNase-Free DNase（Promega）、M-MLV 逆轉錄酶（Promega）、瓊脂糖（SunShineBio）、RNase-Free RNase inhibitor（Promega）、DNA Maker DL 2000（TaKaRa）、5xLoading Buffer（TaKaRa）、GelRedTM10000X in water（BLOTIUM）、0.25%胰蛋白酶（吉諾生物）、50×TAE（上海生工）、GoTaq Green Master Mix（Promega）、SMARTScribe Reverse Transcriptase（Clonetech）、TIANgel Mini Gel Extraction Kit（Tiangen）、pMD 18-T Vector（TaKaRa）、TOP10 感受態細胞（Tiangen）、引物合成及基因測序（Invitrogen）、L-Glutamine、opti-MEM（Gibico）、T4DNA 連接酶（TaKaRa）、pEGFP-N1 表達載體（Clontech）、pMD18-T（Takara）、限制性核酸內切酶（TaKaRa）、X-treme GENE HP DNA Transfection Regant（Roche）、HEK 293 cell line、膜熒光探針DiI（碧云天）、細胞核染料DAPI（碧云天）、蓋玻片（碧云天）、SYBR Green Master Mix（TaKaRa）。

1.2 RNA提取和cDNA合成

將上述5種組織樣品從液氮中取出，研磨后取30 mg樣品，加入1 mL Trizol，用力振蕩、裂解；加200 μL氯仿，振蕩15 s室溫放置5 min；置于冷凍離心機，12 000×g，4°C，離心15 min；離心后，用新離心管吸取400 μL上清水相，再加400 μL異丙醇，完全混勻于-20°C靜置15 min以上；4°C下12 000×g離心15 min，使RNA沉淀；吸掉上清液，后加1 mL 75%的乙醇（75%的乙醇現配并-20°C預冷）洗滌RNA沉淀，12 000×g，4°C，離心10 min；棄上清液，重復洗滌1次；去上清液后離心1 min，吸去剩余液體，干燥RNA沉淀10 min；加30 μL DEPC水使RNA沉淀溶解，獲得總RNA樣品，經瓊脂糖電泳檢查RNA的完整性，NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA的濃度，檢測后的RNA放在-80℃冰箱中保存。

1.3 刺參NPSR-like基因cDNA全長克隆及序列分析

根據GenBank中已知的刺參NPSR-like基因序列，利用Primer5.0軟件設計NPSR基因的核心片段引物（表1）；按照FirstChoiceRLM-RACE Kit試劑盒說明書（賽默飛世爾）設計3'-RACE和5'-RACE引物。將已經反轉好并保存的刺參cDNA作為模板，用NPSR-F和NPSR-R引物進行AjNPSR-like基因核心片段的擴增。同時設計3'-RACE和5'-RACE特異性引物（表1），進行3'和5'末端擴增。擴增產物經凝膠電泳檢測后按照膠回收試劑盒說明書切膠回收，TA克隆，篩選陽性克隆菌落送公司測序。

在 NCBI上利用在線 ORF Finder（http:www.ncbi.nlm.gov/orffinder/）查找開放閱讀框（ORF）；用 Net-Phos2.0Server（http://www.cbsdtu.dk/services/NetPhos/）預測蛋白質磷酸化位點；用ScanProsite tool（http://prosite.expasy.org/scanprosite/）預測二硫鍵位置；Signal4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測信號肽序列；用PredictProtein（http://www.predictprotein.org/）預測蛋白質的二級結構；用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）預測蛋白質的三級結構；用 InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）預測蛋白功能結構域；用TMpred（http://www.ch.embnet.Org/software/TMPREDform.html）預測蛋白跨膜結構域；氨基酸序列多重比對用ClustalX軟件；采用鄰位法（Neighbor-Joining）用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹，1 000次bootstraps，其余參數使用默認值。

1.4 AjNPSR-like在細胞中的定位

為探究AjNPSR-like的亞細胞定位，通過構建表達載體pEGFP-N1，獲得AjNPSR-EGFP的融合蛋白表達載體并通過測序驗證載體準確性，構建好的載體命名為pAjNPSR-EGFP。所用HEK293細胞采用DMEM高糖完全培養基培養（DMEM高糖培養基+10%胎牛血清+1%雙抗）。細胞培養在37°C、5%CO2、濕度衡定的恒溫培養箱（Thermo,USA）中進行。使用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent（Roche）按其說明將AjNPSR-EGFP轉染至HEK293細胞，12～16 h后，將瞬時轉染AjNPSR-EGFP的HEK293細胞經胰蛋白酶處理后接種于載玻片上。24 h后，膜熒光探針DiI染膜，細胞核染料DAPI染核，多聚甲醛固定后封片，置于激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5II）下檢測熒光信號分布情況。

表1 刺參NPSR-like基因克隆與表達分析的引物Tab.1 Primers designed for cloning and expression analysis of AjNPSR-like gene from A.japonicus

1.5 AjNPSR-like基因表達特征分析

用實時熒光定量PCR方法，以刺參β-tubulin基因[28]作為實驗的內參基因，檢測分析不同組織和夏眠刺參AjNPSR-like基因的表達特征。其擴增體系為：cDNA模板0.4 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMII 5 μL，上下游引物各 0.4 μL（表 1），ROX Reference DyeII 0.2 μL，ddH2O 補足至 10 μL。反應程序：94 ℃ 40 s；95℃ 10 s，60℃30 s，40個循環；55～95℃逐漸升溫2 min。實驗進行3次重復。

標準曲線和CT值等由ABI7500 Real Time PCR儀自帶的軟件完成。將熒光定量PCR檢測結果導出，采用2-△CT法，用SPSS 17.0軟件分析。用Duncan法多重比較檢驗組間差異的顯著性，P＜0.05檢查差異顯著。相關柱形圖用軟件Origin 8.0來制作。

2 結果

2.1 AjNPSR-like基因全長cDNA序列分析

AjNPSR-like基因的cDNA全長2 498 bp（GeneBank登錄號：MG199219），開放閱讀框1 272 bp，編碼423 個氨基酸，5＇非編碼區（5＇UTR）716 bp，3＇非編碼區（3＇UTR）510 bp。預測 AjNPSR-like蛋白的理論分子量為47.675 ku，理論等電點為9.45。ScanProsite tool預測二硫鍵位置在C112和 C187，有7次跨膜區；通過SignalP 4.1 Server分析發現沒有信號肽酶切位點；同時含有1個糖基化位點，46個磷酸化位點（圖1）。在線預測其3D結構發現具有7段跨膜結構域（圖2-a），其二級結構預測亦同樣表明有7段跨膜結構域（圖 2-b）。

2.2 AjNPSR-like同源比對與系統進化樹分析

通過NCBI BLAST軟件對AjNPSR-like預測蛋白序列在線比對，結果顯示該序列與紫海膽Strongylocentrotus purpuratus NPS/CCAP-type（CCAP：crustacean cardioactive peptide）受體（SpNPSR）的相似性最高，為47%。多序列比對顯示AjNPSR-like與其他物種NPSR/CCAPR有中等程度的同源性（圖3）。

系統進化樹顯示（圖4），NPSR及其同源基因CCAPR具有明顯的進化分布特征，脊椎動物中為NPSR聚為一支；無脊椎動物中主要聚為兩支，一支為后口動物的棘皮動物，包括海百合Antedon mediterranea、海星Asterias rubens、刺參、紫海膽，一支為原口動物的軟體動物、節肢動物等，包括長牡蠣Crassostrea gigas、光滑雙臍螺Biomphalaria glabrata，溫室希蛛Parasteatoda tepidariorum、埃及伊蚊Aedes aegypti、黑腹果蠅Drosophila melanogaster、赤擬谷盜Tribolium castaneum、大紅斑蝶Danaus plexippus、二化螟Chilo sup-pressalis和棉鈴蟲Helicoverpa armigera，主要命名為CCAPR。刺參AjNPSR-like與紫海膽NPS/CCAP-type受體、海星NPS/CCAP-type受體的進化關系最近，之后與海百合NPS/CCAP-type受體聚為另一分支，與其他脊椎動物NPSR聚為另一大支。該進化樹分析結果展示了棘皮動物中NPSR或其同源受體具有較高的相似性，并與其進化地位保持一致。

圖1 刺參NPSR-like基因全長cDNA序列和對應的氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA sequence and corresponding amino sequence of NPSR-like gene of A.japonicus

圖2 預測AjNPSR-like其蛋白結構和跨膜區域Fig.2 Predicted AjNPSR-like protein structure and domain organization

圖3 AjNPSR-like氨基酸序列與其他物種同源蛋白的多序列比對Fig.3 Multialignment of AjNPSR-like with homologies from other species

圖4 根據AjNPSR-like氨基酸序列構建的NJ系統進化樹Fig.4 NJ phylogenetic tree analysis of AjNPSR-like amino acid sequence from A.japonicus and other species

圖5 融合蛋白AjNPSR-EGFP在HEK293細胞中的表達Fig.5 Confocal microscopy of HEK293 cells expressing the AjNPSREGFP fusion protein

2.3 AjNPSR-like在HEK293細胞中的亞細胞定位

為分析AjNPSR-like亞細胞定位，本研究將構建的pAjNPSR-like-EGFP的融合表達質粒瞬時轉染至HEK293細胞，24 h后，多聚甲醛固定，用DiI染膜，DAPI染核，后封片，置于激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。觀察顯示，在成功轉染pAjNPSR-like-EGFP的HEK293細胞中，能觀察到明顯的熒光，且細胞形態良好，轉染成功的熒光主要分布在細胞膜上，與膜染料DiI熒光信號重疊（圖5）。結果證明pAjNPSR-like-EGFP受體融合蛋白定位于細胞膜，其C端EGFP標記不影響AjNPSR-like蛋白表達和膜定位，證明本研究克隆得到的AjNPSR-like是跨膜蛋白，這與基于生物信息學預測的A-jNPSR-like屬于G蛋白偶聯受體家族結果一致。

2.4 AjNPSR-like基因在刺參成體不同組織中的表達差異分析

AjNPSR-like mRNA在非夏眠刺參呼吸樹、消化道、體壁、肌肉、神經環等5個組織中均有表達，但表達水平有所差異，在肌肉中表達量最高，其次為體壁和神經環；在夏眠期間，刺參各組織中的AjNPSR-like mRNA表達水平顯著上升，且在消化道、體壁、肌肉和神經環中AjNPSR-like的表達極顯著高于非夏眠期間A-jNPSR-like的表達量（圖6）。

圖6 AjNPSR-like基因在5個組織中的表達差異分析（n=3）Fig.6 Expression level of AjNPSR-like mRNA in five tissues of A.japonicus

3 討論

本研究通過RACE技術克隆獲得刺參AjNPSR-like基因的cDNA序列的全長為2 498 bp，編碼423個氨基酸，預測蛋白結構分析其具有GPCR家族典型的7次跨膜螺旋結構（7 TM helix），這些TM區在受體活化、磷酸化、受體表達、信號傳遞等方面起重要作用，跨膜蛋白在細胞中常以離子通道形式存在，執行信號傳導或物質轉運功能[29]。其氨基酸序列與紫海膽NPS/CCAP受體相似性最高，為47%，這與其進化地位一致。BERNIER，et al[30]研究了NPS結構和功能的關系，發現NPS N端1/3的氨基酸殘基對受體的激活是必須的；前 6個氨基酸特別是第 2（Phe，苯丙氨酸）、3（Arg，精氨酸）、4（Asn，天冬氨酸）和 6個氨基酸殘基（Val，纈氨酸）是激活受體所必需的。NPS與NPSR結合后，可引起細胞內Ca2+瞬時增加，也可使細胞內cAMP水平升高，表明NPS偶聯的主要是Gs和Gq蛋白[31]。刺參NPSR-like氨基酸序列與多個物種的NPSR及同源基因CCAPR氨基酸序列進行系統發生分析，顯示刺參NPSR-like與棘皮動物的NPSR/CCAPR聚類，并與脊椎動物的NPSR家族和原口動物的軟體動物和節肢動物的CCAPR家族各自聚成一支，這一方面說明NPSR/CCAPR系統在進化過程中經歷了明顯的演變過程，亦說明深入開展棘皮動物NPSR/CCAPR具有重要的基礎理論價值。

目前研究認為，棘皮動物NPSR/NPSR-like與無脊椎動物心臟加速肽受體（CCAPR）同源；且NPSR/NPSR-like/CCAPR這組受體與脊椎動物、非脊椎動物血管加壓素樣受體（VP/OT-type receptor）系統發育關系最為密切[32]。已有研究表明，棘皮動物中存在的NG肽，一方面與無脊椎動物中的NPS有著共同的Asn-Gly基序，另一方面NG肽的前體肽具有激素運載蛋白結構域，而這種結構域在過去的研究中認為是VP/OT-type（Vasopressin/Oxytocin-type）肽的前體肽中所特有的，因此棘皮動物中存在的NG肽及其受體可以被看做是進化過程中連接NPS/NPSR系統和VP/OT-type肽及其受體的橋梁[33-34]。在進化過程中，很可能是VP/OT系統在基因的加倍過程中，一個拷貝保持了VP/OT系統在演化中的穩定，另一個拷貝則發生了改變從而演化出無脊椎后口動物中的NG肽系統和原口動物的CCAP系統[32]。目前紫海膽中脊椎動物NPSR的同源受體被克隆和鑒定，被稱為NPS/CCAP-type受體，它能夠被紫海膽的一種NG肽：NGFFFamide所激活，該神經肽由包含運載蛋白的前體蛋白衍生而來[35]。這一發現將脊椎動物中的NPS型受體、無脊椎動物中的NG肽以及CCAP型受體聯系起來。紫海膽NGFFFamide受體是第一個以棘皮動物為特征的NPSR-type受體。本研究后續的工作將使用刺參中的一種候選NG肽：NGIWYamide來探究其對A-jNPSR-like的激活情況，從而進一步揭示其在系統進化方面具有的重要意義。

實時熒光定量數據顯示，AjNPSR-like mRNA在外周組織中均有分布，這與XU Yanling，et al[2]在大鼠中的研究結果相似，說明AjNPSR-like在刺參中可能也參與多種生理活動的調控。有研究人員發現，NPSR可以抑制大鼠、小鼠、雞的攝食[14-15,36]，也有研究報道NPSR能促進大鼠的進食[16]。NPSR在刺參夏眠階段消化道中的表達量明顯提高，提示可能抑制了夏眠期間刺參的攝食。另外，有研究指出，NPS通過激活其受體NPSR可抑制小鼠杏仁核和額葉皮質5-羥色胺（5-HT）的釋放[37]，而5-HT作為重要的單胺類神經激素，在動物的攝食調控中發揮著重要作用，與刺參夏眠代謝調控存在相互作用[38]。在運動方面，NPS通過激活NPSR調節基底神經節的活動從而發揮增強運動水平的作用[39]。但由于刺參屬于無脊椎動物，缺乏高級的中樞神經系統，因此需要進一步的研究來闡明NPSR是如何通過其神經系統來調節攝食和代謝的，特別是其在刺參節律行為的調控作用方面的作用研究亦值得關注[40]。目前對于NPSR的體內體外研究主要集中于嚙齒類動物（大鼠、小鼠、兔）[41-42]及哺乳動物（人、豬）[10,43]上，對于無脊椎動物NPSR的組織表達、生理功能等研究報道較少，因此有必要開展這方面研究，進一步闡明NPSR系統在物種進化中的演變，并為研究NPSR在棘皮動物等低等動物中的功能及生理調控機理提供理論基礎。

綜上所述，本研究對刺參AjNPSR-like的基因全長及其編碼蛋白進行了特征分析，確定了AjNPSR-like受體蛋白的亞細胞定位特征，研究了其在刺參不同組織中的轉錄表達水平及夏眠期間的高表達特征，探討了NPS/NPSR系統可能在刺參生理調控中的作用，為進一步探究該系統的生理調控功能及進化演變奠定基礎。