貝類閉殼肌-貝殼連接界面的分子組成及連接機制

廖 智，孫 琦，姜雨婷

（浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江舟山 316022）

貝殼是多數軟體動物用以保護其內部軟組織的一層硬殼，其主要成分是碳酸鈣，占貝殼總質量95%以上。作為一種高度結構化的，具有優異力學性能的天然納米復合材料，貝殼相關研究不僅是仿生學及生物材料學研究的重要領域，同時，在生物醫學工程以及生物材料工程方面也顯示出廣闊的應用前景[1-4]。目前，針對貝殼的研究主要包括貝殼微觀結構的類型、組裝、碳酸鈣晶體結構及形成過程分析，貝殼中無機質和有機質成分組成以及組裝特征分析，貝殼中蛋白質（即貝殼基質蛋白）的分子組成、結構以及對碳酸鈣晶體形成的影響分析等。此外，貝類的肌肉與貝殼之間的連接界面，如蝸牛的中柱肌-貝殼，雙殼貝類的后閉殼肌-貝殼連接界面等，也引起人們的關注。貝類中柱肌或閉殼肌均屬肌肉組織，而貝殼是由碳酸鈣晶體構成的非細胞組織，兩者之間的連接不僅涉及生物大分子之間的相互作用，還涉及有機物-無機物之間的結合，其本質屬于生物粘附研究范疇。考慮到目前肌肉與生物硬組織之間的生物粘附是生物醫學工程和生物材料學的重要研究內容，也是組織工程材料的研發，植入，修復和替代等研究的基礎。因此，貝類的閉殼肌與貝殼的連接界面研究一方面可以為組織工程材料在人體中的移植修復等過程中，構建材料與受體組織間的粘附提供很好的仿生學啟示；另一方面，該界面研究所涉及的，參與連接的關鍵蛋白分子可作為先導分子，在新型人工肌腱材料的研發中具有重要意義。

1 貝殼與貝殼基質蛋白

對貝殼的研究起始于對貝殼結構的微觀觀察和力學分析。在早期研究中，人們已注意到貝殼具有極為復雜的微觀結構。隨著技術進步，近20年來，人們開始關注貝殼中各種有機質成分，特別是蛋白質分子在貝殼中的組成、分布以及對貝殼形成的影響，相關研究逐年增多。以mollusc shell作為關鍵詞搜索Pubmed數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=mollusc+shell），可見1970-2017年，貝殼相關研究的年發表文章數量呈明顯上升趨勢（圖1）。上述研究為了解貝殼肌肉-貝殼連接界面奠定了基礎。而針對軟體動物肌肉-貝殼連接界面的研究則在上世紀七十年代有少量結構分析報道，之后長期處于停滯狀態。隨著對貝殼結構以及貝殼基質蛋白組成的深入了解，這一方面的研究在近幾年才逐漸受到重視，但總體而言，相關研究仍然極少。由于貝類肌肉-貝殼的連接界面的研究是建立在貝殼自身結構及貝殼基質蛋白的結構與功能研究基礎之上，因而本文首先關注貝殼與貝殼基質蛋白的研究進展。

圖1 1970-2017年，Pubmed數據庫收錄的貝類貝殼相關研究文章的發表數量Fig.1 The number of published papers in the field of mollusc shell at 1970-2017 from Pubmed database

貝殼是由碳酸鈣晶體經過層層組裝而成。貝殼中的碳酸鈣晶體其主要晶型為方解石（Calcite）和文石（Aragonite）兩種物相結構[5-7]。根據碳酸鈣晶型和形貌的區別，可將貝殼結構分為不同的微觀結構層次，常見的有三種，即珍珠質層（Nacre），棱柱層（Prismatic layer）和斜交叉層（Obliquely Crossed Crystals）[8-9]。上述分層僅是從貝殼的整體結構而言所做的一個簡單分層，事實上，不同貝類的貝殼結構，不論是整體外形還是微觀結構組成方面，均表現出明顯的結構多樣性特征[10-11]。根據CARTER[11]對不同貝類貝殼的掃描電子顯微鏡觀察結果，報道了至少七組不同類型的微結構，包括棱柱組（Prismatic）、球狀組（Spherulitic）、板狀組（Laminar）、交叉組（Crossed）、均質組（Homogeneous）、孤立針狀組（Isolated spicules and spikes）以及孤立晶體組（Isolated crystal morphotypes）。不同貝類的貝殼中，其微觀結構的組裝形式和種類不一樣，但通常包括上述2～7種結構層次。不同的微觀結構層次往往也具有不同的力學性能，目前發現貝殼中，參與和肌肉連接的結構層次主要是肌棱柱層（myostracum），屬于棱柱組類型。

貝殼所具備的優異力學性能不僅來自于碳酸鈣晶體在納米層次的結構組裝，也來自于貝殼中各種有機質成分的輔助[12]。有機質是貝殼的重要組成成分，盡管其含量較低，不到貝殼總質量的5%，但對貝殼的形成以及貝殼的力學性能起到了至關重要的作用。特別是其中的蛋白質，貝殼基質蛋白（Shell Matrix Protein，SMP），直接影響了貝殼碳酸鈣晶體的成核以及定向生長等過程[12-15]；而貝殼中的其他有機物，如幾丁質等成分，在貝殼的貝殼無機相與有機相的分子連接以及構建貝殼框架結構中發揮著關鍵作用[16-17]。在貝殼有機物的指導和調控下，最終將碳酸鈣晶體沉積形成具有不同微觀結構層次的貝殼，這一過程被稱之為生物礦化（Biomineralization），這也是一個無機相-有機相不同分子的相互識別和相互作用的過程[18]。同時，貝殼基質蛋白中，也必然有一部分蛋白參與了貝殼與肌肉組織之間的連接，因而貝殼基質蛋白的研究為從中篩選參與肌肉-貝殼連接的關鍵蛋白奠定了基礎。

目前已報道的貝殼基質蛋白種類眾多，目前在美國國立醫學圖書館的蛋白質數據庫（National Center for Biotechnology Information Search database）中，以“molluscs shell matrix protein”作為關鍵詞可搜索到的蛋白質種類達到785種，可歸屬于37個蛋白質家族（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ipg?term=molluscs%20shell%20matrix%20protein）。其物種來源涉及142種軟體動物，絕大多數來自雙殼綱Bivalves，少數來自腹足綱Gastropods和頭足綱Cephalopods。其分子大小從95個氨基酸殘基（數據庫編號：AAQ08227.1）到1 912個氨基酸殘基（數據庫編號：JAP63242.1）不等。就單獨的貝類貝殼而言，一種貝類貝殼中所包含的貝殼基質蛋白種類推測在200種以上[19]，但在實際研究時，由于貝殼基質蛋白的含量極低，且通常水溶性極差，因而即使采用蛋白質組學策略，往往也只能鑒定到其中數十種豐度較高的基質蛋白。例如，UPADHYAY，et al[20]從牡蠣Crassostrea hongkongensis和C.angulata的貝殼中分別鑒定到42和37種貝殼基質蛋白；ARIVALAGAN，et al[21]從蛤 Mya truncata的貝殼中鑒定到 67種貝殼基質蛋白；LIU Chuang，et al[22]從珠母貝Pinctada fucata的貝殼中鑒定到72種貝殼基質蛋白；筆者也分別從地中海貽貝Mytilus galloprovincialis和厚殼貽貝M.coruscus貝殼中分別鑒定到113和63種貝殼基質蛋白等[23-24]。已報道的貝殼基質蛋白往往具有特定的結構域或特殊的氨基酸組成，且在貝殼不同微觀結構層次中也具有不同的分布特征[25]。因此可以根據貝殼基質蛋白在貝殼不同層次或者不同晶型碳酸鈣中的分布大致可將貝殼基質蛋白分為珍珠質層特有基質蛋白，棱柱層特有基質蛋白等，或方解石層特有基質蛋白，文石層特有基質蛋白等[26]。由于相關綜述較多，因此筆者在此不做贅述。但值得注意的是，由于參與貝類閉殼肌-貝殼連接的主要結構層次是屬于棱柱層的肌棱柱層，因而該層所特有的貝殼基質蛋白很有可能參與了該界面的連接。

上述研究不僅使人們了解貝殼自身的結構特征及貝殼基質蛋白的種類和分布特征，同時也發現參與肌肉連接的貝殼部位與非肌肉連接的貝殼部位在微觀結構和蛋白質分子組成方面具有明顯差異，這為貝類肌肉-貝殼連接界面的相關研究起到了重要的推動作用。

2 貝類肌肉-貝殼連接界面的連接模型

貝殼中，特別是雙殼貝類的后閉殼肌-貝殼連接界面（adductor-muscle-shell attachment，AMS）不僅涉及生物大分子之間的相互作用，還涉及有機物-無機物之間的粘附。目前在人造骨骼移植以及人工肌腱材料的臨床應用中，均面臨人造骨骼和肌肉間不易產生粘連，粘附力不足易斷裂以及生物相容性差等問題[27]。而貝類的閉殼肌與貝殼的連接界面涉及到兩種不同的組織體系（肌肉和貝殼）間的連接，因而該連接界面的研究對相關生物醫學和材料學研究具有很好的啟示意義。因此，對于貝類肌肉與貝殼之間的連接，人們首先關注的是其力學性能以及該界面的微觀結構。雙殼貝類閉殼肌通過緊密結合貝殼，可將兩片貝殼緊緊的拉在一起（圖2）。對雙殼貝類而言，閉殼肌收縮時產生的作用力極強，GALTSOFF[28]曾報道，牡蠣C.virginica的貝殼閉合后，需20 kg的拉力方可將其拉開；而在強行拉開牡蠣閉合的雙殼過程中，斷裂部位通常發生在閉殼肌內部，而閉殼肌與貝殼的連接界面仍然保持完整。上述研究一方面表明閉殼肌本身具有較強的收縮力，另一方面也表明貝類閉殼肌與貝殼之間的連接極為緊密，具有很高的連接強度。考慮到閉殼肌主要成分為肌纖維，而貝殼主要成分為碳酸鈣晶體，這兩者之間的連接作為一種典型的無機相-有機相連接模式，人們首先關注的是其連接結構。

目前，對于貝類肌肉-貝殼連接界面微觀結構的研究早期主要集中在鸚鵡螺以及腹足類的中柱肌-螺殼的連接界面，例如 ISAJI，et al[29]對于鸚鵡螺以及 TOMPA，et al[30]對陸生蝸牛的中柱肌-殼連接界面的微觀結構研究；在上述研究中，研究者提出了一個“上皮（肌腱）細胞-半透明膜-貝殼”（epithelium-semitransparent membrane-shell junction）的連接模型（圖3）。肌肉細胞通過肌腱細胞（tendon cell）實現與殼之間的連接。同時，上述研究還觀察到肌肉中有少量纖維組織深入到殼層內部，從而有利于強化這種連接。

雖然該模型從細胞層面對肌肉-貝殼連接界面的結構特征進行了描述，但是該模型是建立在鸚鵡螺以及蝸牛的中柱肌與殼的連接方式基礎上，而中柱肌-殼的連接強度遠遠低于雙殼貝類的閉殼肌-貝殼連接[30]；另一方面，該模型側重于細胞及組織水平構建一個連接模型，而對于在這一連接界面中有哪些分子起到了關鍵作用以及相關連接的分子機理并未涉及。對雙殼貝類的閉殼肌-貝殼連接界面研究起始于對連接界面的微觀結構觀察，例如早期NAKAHARA，et al[31]利用電鏡觀察了貝類Pinctuda rudiatu閉殼肌-貝殼連接界面，SONG Yingfei，et al[32]對地中海貽貝的后閉殼肌-貝殼的連接界面的電鏡觀察，以及近期ZHU Yaoyao，et al[33]對三種雙殼貝后閉殼肌痕的微觀結構觀察。上述研究報道了該界面的微觀結構，特別是貝殼部分的碳酸鈣晶體結構，而并未涉及肌肉-貝殼的分子組成以及連接機理。上述研究雖然提供了一個貝類-肌肉連接的模型，但相關分子機制仍依賴于貝殼類各種基質蛋白的研究，特別是需要通過蛋白質組學手段首先判斷貝殼與肌肉連接的部位有哪些蛋白質分子的存在，且這些蛋白不涉及貝殼自身晶體結構的形成，而是涉及兩種界面的連接或者粘附，這方面的工作仍然任重而道遠。

圖2 厚殼貽貝后閉殼肌（posterior adductor）以及伸（縮）足肌群（retractor muscle與貝殼內層連接部位（圖片摘自筆者未發表數據）Fig.2 The posterior adductor between shells and the retractor muscles between mussel foot and shell in M.coruscus （from unpublished data）

圖3 蝸牛（Gastropod）中柱肌與殼連接的模式圖（摘自TOMPA，et al[30]）Fig.3 Diagrammatic representation of the gastropod muscle attachment to the shell （from TOMPA,et al[30]）

3 雙殼貝類后閉殼肌痕的微觀結構和蛋白質分子組成

在雙殼貝類中，閉殼肌與貝殼連接的部位被稱為后閉殼肌痕（Adductor Muscle Scar，AMS）[34-35]。在該部位，后閉殼肌肌纖維直接連接于貝殼內側，其連接部位的主要貝殼結構層次為肌棱柱層（Myostracum）。肌棱柱層為單層柱狀結構，在外型上與珍珠質層和纖維棱柱層差異較大，在貝殼中所占比例較低且往往包埋在貝殼內部（圖4），但在肌肉-貝殼連接界面，即后閉殼肌痕部位，該層暴露于貝殼內側表面并直接與后閉殼肌連接，這意味著肌棱柱層在貝殼與肌肉的連接中發揮著重要作用，也必然存在某種分子機制將肌棱柱層與后閉殼肌兩種完全不同的物相體系緊密結合在一起。肌棱柱層碳酸鈣晶型通常為文石型[36-37]或者文石型和方解石型混合[32]。GAO Peng，et al[23]的研究表明，地中海貽貝貝殼的肌棱柱層中，含有34種肌棱柱層特有的基質蛋白，其中，包括Calponin類蛋白，Transgelin類蛋白，含THY結構域（thymosin beta actinbinding motif）的蛋白等。上述蛋白序列中含有Calponin，Calponin-homology以及THY等具有肌動蛋白結合功能的結構域。推測肌棱柱層中該類型蛋白可能參與了與閉殼肌中肌動蛋白的結合，從而使得肌棱柱層與閉殼肌組織緊密的連接在一起，最終介導了貝殼的閉合[38]。此外，在地中海貽貝以及厚殼貽貝肌棱柱層中還發現豐富的膠原類蛋白[23-24]；而此前已知膠原蛋白酶處理可以有效地降低牡蠣C.virginica后閉殼肌與貝殼之間的結合力[28]。上述研究表明，膠原類蛋白可能也在貝殼-肌肉的連接中發揮著重要作用。此外，ZHAO Che，et al[39]的研究表明，在蝦夷扇貝Patinopecten yessoensis閉殼肌-貝殼連接部位的表面結構中，存在直徑約為7 μm的孔洞結構（Pit structure），并推測該孔洞可能是膠原蛋白在閉殼肌-貝殼連接界面的貫穿部位。對貽貝的后閉殼肌痕表面結構研究也有類似發現[40-41]。同時，在研究中，還發現地中海貽貝的后閉殼肌與肌棱柱層表面之間存在一層有機質膜，且發現肌肉組織與該膜之間存在纖維狀物質的連接[41]（圖5），同時，SONG，et al[32]發現在貽貝貝殼內部也存在纖維狀連結物質。上述研究表明，閉殼肌與貝殼肌棱柱層之間的連接可能不僅有成膜蛋白的參與，也有纖維類蛋白質的參與，由此形成了肌肉-膜-貝殼的連接體系，且該體系有膠原類蛋白貫穿并加強了該連接界面的強度。

圖4 幾種代表性貝類的肌棱柱層電鏡圖像Fig.4 The SEM photo of myostracum from some representative bivalves

圖5 貝類后閉殼肌痕部位表面結構Fig.5 The SEM photo of AMS surface from some representative bivalves

目前，關于閉殼肌-貝殼連接界面的研究由于涉及生物化學，分子生物學，生物力學，生物物理學等多個學科，綜合性較強，研究難度較大，相關研究也較少，目前對該界面連接的分子機制也多數處于推測狀態，但隨著研究的深入，人們必將深入了解該連接界面的分子機制并對仿生學和生物材料學研究產生深遠影響。