多肽對凡納濱對蝦生長、消化酶和免疫酶活力的影響

廖栩崢，陳金榮，劉永勝，秦海鵬，王 博，胡世康，陳燮燕，曲 朋，孫成波

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江 524088；2.煙臺市水產(chǎn)研究所，山東煙臺 264003；3.山東深海生物股份有限公司，山東煙臺 265500）

抗菌肽最早是與1972年由科學(xué)家FERNANDEZ，et al[1]的研究中得知植物中含有具抑制細(xì)菌活性的硫素，同年瑞典科學(xué)家BOMAN，et al[2]在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了抗菌肽及其作用，之后在1989年HULTTMARK，et al[3]從惜古比天蠶蛹中分離出第一種抗菌肽，并且命名為天蠶素。從此之后，人們陸續(xù)可以從植物、兩棲動物、哺乳動物、昆蟲等各種生物中提取得到不同的抗菌肽。截止目前，經(jīng)過報道的抗菌肽種類已高達(dá)2 901種。生物活性多肽是目前普遍存在于動植物、細(xì)菌體內(nèi)的一類小分子多肽，小分子多肽具有合成成本低、提供能量速度快、消化吸收利用率高、可提高新陳代謝和具有高效抗病能力等優(yōu)點(diǎn)[4-7]，多肽菌素S100專用型源自動物腸道分離的一株有益菌，經(jīng)體外培養(yǎng)、發(fā)酵調(diào)控產(chǎn)生的一組活性物質(zhì)。

凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei具有生長速率快、耐高溫及養(yǎng)殖區(qū)域廣等優(yōu)點(diǎn)，是世界三大經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖對蝦之一[8]，但是近年來隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，其病害為題日益嚴(yán)重。為預(yù)防和治療對蝦的疾病造成的影響，部分對蝦養(yǎng)殖戶濫用化學(xué)消毒及和抗生素，導(dǎo)致病株的抗藥性加強(qiáng)并且對養(yǎng)殖水體造成破壞，同時也給食品安全帶來巨大的安全隱患。抗菌肽的發(fā)現(xiàn)可以提高凡納濱對蝦的生長速率，加強(qiáng)對蝦的體質(zhì)，是水產(chǎn)動物防御系統(tǒng)的主要成分之一，對此可以提高水產(chǎn)動物的抗病能力。多肽菌素在水產(chǎn)中的研究現(xiàn)在主要集中在分離純化以及抗菌活性方面[9-11]，在小分子多肽對蝦蟹類養(yǎng)殖生產(chǎn)性能方面研究較少[12-13]，本實(shí)驗(yàn)主要研究在普通飼料中按比例添加兩種多肽菌素，研究對凡納濱對蝦生長、消化酶和免疫酶的影響，為多肽菌素在凡納濱對蝦生產(chǎn)中的推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地點(diǎn)在廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地進(jìn)行。試驗(yàn)挑選體長為2.35±0.40 cm，體質(zhì)量為0.16±0.07 g的凡納濱對蝦作為試驗(yàn)用蝦，池塘面積為800 m2，分別放養(yǎng)于12個網(wǎng)箱中，網(wǎng)箱規(guī)格為3 m×3 m×1.5 m，每一個網(wǎng)箱放養(yǎng)3 000尾。多肽實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品由山東深海生物科技股份有限公司提供的多肽菌素S100專用型（主要成分：Υ-多肽菌素，靶心裂解素，益生菌，裂解酶）。

1.2 試驗(yàn)分組

多肽采用菌素S100專用型分別按照0.2%、0.5%、1.0%的添加量混合添加基礎(chǔ)飼料,組別名稱為S100專用型0.2%、S100專用型0.5%、S100專用型1.0%，同時設(shè)計(jì)空白對照組，每組3個重復(fù)。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)時間為123 d，投喂時間為07:00、11:00、18:00、23:00，每天觀察對蝦的攝食情況和生長情況。試驗(yàn)期間養(yǎng)殖水體鹽度為 20.92～25.61，連續(xù)充氧，pH 6.61～8.31，溫度為 23.0～34.2 ℃[2]。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 生長指標(biāo)

試驗(yàn)期間，每隔10 d分別從每一個網(wǎng)箱中隨機(jī)取30尾對蝦，測量其體長（眼睛前端到蝦尾帶肌肉部位的末端）、分子電子天平測量體質(zhì)量。

1.4.2 消化酶和免疫酶測定

試驗(yàn)結(jié)束后每一個網(wǎng)箱取15尾對蝦剝離肝胰臟，分別稱重，按比例加入相應(yīng)緩沖液制成10%勻漿液，3 000～5 000 r/min，4℃低溫離心15～20 min，取上清液分裝與1.5 mL Eppendorf管中，并立即保存到-80℃冰箱中，備用進(jìn)行消化酶、免疫酶的測定。脂肪酶（LPS）、淀粉酶（AMS）、溶菌酶（LZM）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用南京建成生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

生長指標(biāo)主要計(jì)算公式：特定生長率（Specific growth rate,SGR）=100%×[ln（終末體質(zhì)量）-ln（初始體質(zhì)量）]/試驗(yàn)時間

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)合Duncan’s法進(jìn)行多重比較，P＜0.05時處理組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對蝦生長指標(biāo)變化規(guī)律

0.2 %添加組的日平均增長是最快，對照組的日平均增長最慢；試驗(yàn)后平均體長最大的組別是0.2%添加組（10.61±0.538 cm），試驗(yàn)后平均體長最小的組別是對照組（9.98±0.574 cm）；0.2%添加組和1.0%添加組與對照組對比存在顯著性差異（P＜0.05），具體見表1。

0.2 %添加組的特定生長率是最大，對照組的特定生長率是最慢；試驗(yàn)后平均體質(zhì)量最大的組別是0.2%添加組（14.270±2.248 g），實(shí)驗(yàn)后平均體質(zhì)量最小的組別是對照組（12.200±1.877 g）；0.2%添加組與對照組對比有顯著性差異（P＜0.05），具體見表2。

表1 凡納濱對蝦體長變化Tab.1 Changes in body length of L.vannamei

表2 凡納濱對蝦體質(zhì)量變化Tab.2 Changes in body mass of L.vannamei

2.2 淀粉酶（AMS）活性

0.5 %添加組的淀粉酶活力最高為3.04 U/mgprot，1.0%添加組的淀粉酶活力最低為0.91 U/mgprot，0.2%添加組、0.5%添加組和1.0%添加組3個試驗(yàn)組之間存在顯著性差異（P＜0.05）；S100專用型3個濃度梯度的淀粉酶活力與對照組都存在顯著性差異（P＜0.05），具體如圖1所示。

2.3 脂肪酶（LPS）活性

0.5 %添加組的脂肪酶活力最高為665.43 U/gprot，0.2%添加組的脂肪酶活力最低為101.75 U/gprot；0.5%添加組的脂肪酶活力與其他2個濃度梯度存在顯著性差異（P＜0.05），試驗(yàn)組3個濃度梯度的脂肪酶活力與對照組之間存在顯著性差異（P＜0.05），具體如圖2所示。

2.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性

0.5 %添加組的超氧化物歧化酶活力最高為60.80 U/mgprot，對照組的超氧化物歧化酶活力最低為5.70 U/mgprot；0.2%添加組、0.5%添加組和1.0%添加組3個試驗(yàn)組之間存在顯著性差異（P＜0.05），對照組的SOD與0.5%添加組和1.0%添加組的SOD差異明顯（P＜0.05），具體如圖3所示。

2.5 溶菌酶（LZM）活性

0.5 %添加組的溶菌酶活力最高為44.35 μg/mgprot，對照組的溶菌酶活力最低為0.30 μg/mgprot；0.5%添加組的溶菌酶活力與對照組對比差異顯著（P＜0.05）（圖 4）。

圖1 淀粉酶活力Fig.1 Amylase activity

圖2 脂肪酶活力Fig.2 Lipase activity

圖3 超氧化物歧化酶活力Fig.3 Superoxide dismutase activity

圖4 溶菌酶活力Fig.4 Lysozyme activity

3 討論

3.1 飼料中添加多肽[3]菌素對凡納濱對蝦生長性能的影響

生物活性多肽可以促進(jìn)水生動物的生長，從而改善其生產(chǎn)性能，抗菌肽作為一種飼料添加劑已經(jīng)在畜牧業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用，張海文等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)抗菌肽可以提高仔豬的生長性能和提高仔豬的肉質(zhì)品質(zhì)，還有研究表明，抗菌肽可以促進(jìn)肉雞生長和提高產(chǎn)肉率[15]。在多肽菌素對對蝦養(yǎng)殖方面，王廣軍等[16]在飼料中添加1.0 g/kg抗菌肽，在日生長速度、相對增重率、飼料系數(shù)和成活率等方面均顯著高于對照組；黃自然等[17]在池塘養(yǎng)殖凡納濱對蝦的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加4 mL/kg的抗菌肽與添加1.0 mg/kg的金霉素比較，抗菌肽的收獲率和收獲量均顯著提高。多肽菌素的主要成分是多肽，其他成分只是起輔助作用，從生長實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，多肽菌素在飼料中添加對凡納濱對蝦的終末體質(zhì)量和特定生長率都優(yōu)于對照組。以特定生長率來看，最適合添加的多肽菌素和其添加的比例是0.2%添加組[4]。同時又研究表明多肽可以提高凡納濱對蝦的成活率，DESTOUMIEUX，et al[18]研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽的抗菌活性可以在對蝦的蛻皮周期中提供防御保護(hù)，因此在飼料中添加抗菌肽可以提高成活率。

3.2 多肽對凡納濱對蝦消化酶和免疫酶的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表面，0.5%添加組對凡納濱對蝦的脂肪酶（LPS）和淀粉酶（AMS）活性最高，與對照組對比其效果明顯（P＜0.05）[19]。對于抗菌肽的研究，人們在凡納濱對蝦的養(yǎng)殖中最關(guān)注的還是其能夠提高凡納濱對蝦的免疫性功能。在感染期間，非特異性免疫系統(tǒng)比特異性免疫系統(tǒng)更為重要。一些非特異性免疫酶的活力值可以反映凡納濱對蝦免疫性高低的指標(biāo)。抗菌肽可以有效提高水產(chǎn)動物對病原菌的抵抗能力[20]，有研究表明，在飼料中添加抗菌肽可以使湘云鯽中LZM活性提高[21]；在飼料中添加0.4%抗菌肽可以提高河蟹免疫和抗氧化能力起到明顯的作用，可以顯著提高肝臟和肌肉中超氧化物歧化酶（SOD）的活力水平[22]；溶菌酶（LZM）和超氧化物歧化酶（SOD）是非特異性免疫系統(tǒng)中的重要組成部分[23]，在甲殼動物的免疫中起著重要的作用[24]。對蝦的抗菌肽主要是在血液中的血細(xì)胞中表達(dá)，這也是免疫反應(yīng)的主要部位，抗菌肽表達(dá)的血細(xì)胞可以快速遷移到被病原感染的部位起到對抗的作用[25]。在本實(shí)驗(yàn)中0.5%的添加組，對蝦肝臟內(nèi)的LZM和SOD活性[5]最高，對照組的活性最低，并且存在顯著性差異（P＜0.05），說明選擇合適的多肽菌素添加量添加進(jìn)人工配合飼料中可以有效提高凡納濱對蝦的免疫能力。