糞便SFRP2基因甲基化與大腸癌的相關性研究

劉 洋

(青海省第五人民醫院(青海省腫瘤醫院)，青海 西寧810007)

大腸癌包括結腸癌和直腸癌，是一種嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤。目前，大腸癌已成為世界第三大常見腫瘤，西方發達國家的大腸癌病死率居全部惡性腫瘤第二位，在我國居第四位。Wnt信號通路異常是大腸癌發生發展的早期改變，在這個改變過程中，腫瘤細胞不同與正常環境而生長、增殖，同時腫瘤細胞的凋亡數量也減少[1]。作為Wnt信號通路中至關重要的負調節蛋白，SFRPs可能在大腸癌發生發展過程中有重大的意義[2,3]。本研究采用PCR與凝膠電泳的方法測定大腸癌患者SFRP2基因的甲基化狀況，分析結果并探討其是否有望成為大腸癌篩查的重要指標。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2016年1月至2016年12月于我院就診的大腸癌患者40例，患者的檢查結果已通過病理檢查確診，病例納入標準：(1)患者診斷為單一部位腫瘤；(2)患者診斷為首次確診，非復發、轉移；(3)標本采集前未行藥物治療和其他可能影響結果的腸道檢查。大腸癌患者作為觀察組，以健康志愿者作為對照組。大腸癌患者40人，其中男24人，女16人，年齡62-75歲，平均年齡69.03±5.12歲；健康志愿者40人，其中男25人，女15人，年齡62-74歲，平均年齡68.81±5.16歲。經統計學分析，兩組研究對象的一般情況，如年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)，具有良好的可比性。

1.2方法

醫護人員指導患者和志愿者正確收集糞便標本，標本采集后由專人送至實驗室，根據實驗需要分裝后置于零下80℃的冰箱冰凍保存。

1.2.1DNA的提取與純化 采用天根生化科技(北京)有限公司生產的糞便DNA基因組提取試劑盒，按說明書進行操作提取糞便DNA基因組，采用紫外分光光度計檢測提取與純化得到的DNA片段的濃度與純度。

1.2.2DNA的亞硫酸氫鈉修飾 采用北京天漠科技開發有限公司生產的DNA甲基化試劑盒，按說明書進行操作，完成DNA的亞硫酸氫鈉修飾。

1.2.3PCR反應 引物合成：采用針對甲基化和非甲基化序列的引物，由上海英拜生物科技有限公司合成，見表1。

表1 甲基化和非甲基化序列引物

PCR反應條件：反應體系：包括PCR緩沖液5 μl，2.5 mmol/LdNTP4 μl，甲基化上下游引物和非甲基化上下游引物各1 μl，甲基化模板DNA5 μl，Taq酶0.25 μl，加水至總體積50 μl。循環條件：先95℃預變性10 min，然后以95℃變性30 sec，55℃退火30 sec,72℃終末延伸60 sec的循環條件作35個循環，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4瓊脂糖凝膠電泳 取擴增的產物進行瓊脂糖凝膠電泳試驗，瓊脂糖凝膠濃度2%，電壓75 V，45 min。

1.3觀察指標查看瓊脂糖凝膠電泳試驗結果，以陽性對照為標準，出現陽性條帶者為判斷為陽性，統計并記錄陽性例數。

1.4統計學方法采用統計軟件SPSS19.0對研究結果中的各項數據進行分析，定性資料采用卡方計數檢驗法，檢驗水準取α=0.05，以P<0.05作為具有統計學意義的標準。

2 結果

2.1大腸癌患者與健康志愿者糞便SFRP2基因甲基化的凝膠電泳結果對比:大腸癌患者糞便標本可見SFRP2基因甲基化，幾乎所有健康志愿者糞便標本未見SFRP2基因甲基化，見圖1。

圖1 大腸癌患者與健康志愿者糞便SFRP2基因甲基化的凝膠電泳結果

2.2大腸癌患者與健康志愿者糞便SFRP2基因甲基化例數的統計學分析:大腸癌患者中出現甲基化的比率為80.00%(32/40)，健康志愿者出現甲基化的比率為7.5%(3/40)。與健康志愿者相比，大腸癌患者中出現甲基化的比率大大升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組對象糞便標本甲基化情況比較

3 討論

近年來，在世界多數國家，大腸癌的發病率逐漸上升。大腸癌早期無癥狀或癥狀不明顯，癌瘤生長速度緩慢，在其達到機體出現明顯癥狀、體征之前要經過相當長的時間，故臨床前來就診的患者往往癌腫已到晚期[4,5]。早期診斷對于提高大腸癌患者生存率以及改善大腸癌患者生活質量至關重要。目前臨床常用的檢測手段為大腸內鏡檢測、鋇餐造影等檢查，但是這些傳統檢測因檢查過程繁瑣、有創、費時等因素而不適合推廣使用。臨床常用的篩查方法還包括大便隱血試驗和癌胚抗原(CEA)檢測等，這些篩查方法雖然無創，但是敏感性以及特異性較差，臨床應用價值不高[6]。因此，全球癌癥工作者都著手于尋求一種更新的大腸癌檢測手段，能具有簡便、無創、可靠等優點。由于具備諸多優點，糞便DNA檢測已逐漸成為近年來各個國家癌癥工作者檢測大腸癌研究的熱點[7]。

近期的研究顯示，表觀遺傳學改變，尤其是DNA甲基化的改變在大腸癌的發生發展過程中起著重要的作用，DNA甲基化變化被認為是結直腸癌發生的一個關鍵機制。人類有五種sFRP基因，分別為sFRP1基因、sFRP2基因、sFRP3基因、sFRP4基因、sFRP5基因，其中sFRP2基因作為作為Wnt信號通路中至關重要的負調節蛋白，通過使基因沉默的作用，其甲基化改變成為大腸癌一個重要特征。在人體發育的過程中，Wnt信號通路主要在細胞的生長、運動和分化過程中發揮作用，器官和組織成熟后，Wnt信號通路也有助于其內環境穩定。Wnt信號通路異常是大腸癌發生發展的早期改變，在這個改變過程中，腫瘤細胞不同與正常環境而生長、增殖，同時腫瘤細胞的凋亡數量也減少。分泌型卷曲相關蛋白是Wnt信號通路的拮抗物，其含有一個特有的半胱氨酸富含域(CRD)，同Wnt信號的FZ型受體的CRD同源。SFRPs可以使Wnt信號通路受阻，可能的途徑為：(1)與Wnt信號蛋白質相互競爭以阻止它們與FZ型蛋白結合；(2)與FZ型受體形成無功能的復合物，減少FZ型受體復合物對機體的實際作用。SREPs基因甲基化后，阻礙作用下調，Wnt信號通路激活，持續作用于大腸癌發生發展的全過程，腫瘤細胞不斷生長、增殖。因此，作為Wnt信號通路中至關重要的負調節蛋白，SFRPs可能在大腸癌發生發展過程中有重大的意義。

糞便DNA檢測是近年來全球大腸癌檢測研究的熱點方向。正常腸道黏膜細胞在生長、增殖的同時，也有大量細胞更新脫落進入腸腔，隨著糞便排出體外。這提示，在糞便可能存在與癌癥和癌癥細胞相關的化學物質和基因。而癌細胞的增殖代謝相較于正常腸道粘膜細胞更加旺盛，只要使用DNA提取技術將糞便中的DNA提取出來，使用PCR擴增技術擴增相關突變基因，在采用凝膠電泳方法分析產物，就可能達到通過糞便診斷大腸癌的目的[8,9]。本研究分析了大腸癌患者糞便樣本中SFRP2甲基化狀態。結果表明，大腸癌患者中出現甲基化的比率為80.00%(32/40)，健康志愿者出現甲基化的比率為7.50%(3/40)。與健康志愿者相比，大腸癌患者中出現甲基化的比率大大升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。本研究采用亞硫酸鹽處理基因組DNA使其發生甲基化狀態依賴的序列改變，然后進行PCR反應，擴增待檢測的DNA區域。擴增片段中原先未被甲基化的胞嘧啶位點上發生胞嘧啶轉變為胸腺嘧啶的改變，而原先被甲基化的胞嘧啶位點則保持不變。與其他甲基化檢測技術比較，具有以下特點[10,11]：(1)檢測靈敏度高，樣品消耗少，僅需1 μg的基因組DNA。(2)檢測結果更為直觀。(3)可定量檢測靶位點甲基化水平。(4)結果可信，出現假陽性的概率很小。

綜上所述，SFRP2基因的甲基化改變是篩選大腸癌的敏感標志，糞便SFRP2基因甲基化檢測有望成為無創診斷大腸癌的新途徑。