沙眼衣原體LpxA蛋白的表達、純化及多克隆抗體的制備

李德坤，余錦強，邵 杰，汪 艷，劉珍凱，周貴春，穆迎濤

(湖北醫藥學院附屬人民醫院 眼科·十堰市人民醫院 眼科中心，湖北 十堰442000)

沙眼感染性致盲的主要因素之一。隨著衛生條件的改善，目前發達國家及地區沙眼的發病率已經非常低，但是在我國以及亞州、非州和拉丁美洲等一些落后地區沙眼患者的數量依舊仍舊居高不下[1,2]。沙眼的病原菌是沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)，Ct是一種具有獨特二相發育周期、細胞內寄生的革蘭陰性細菌[3,4]。調查發現A、B和C等血清型Ct極其容易感染眼部，從而導致沙眼，D-K型容易感染泌尿生殖道，導致尿道炎、盆腔炎和陰道炎等疾病，開展Ct的致病機制研究具有重要的現實意義[5]。

已有研究證實Ct的質粒蛋白、熱休克蛋白、主要外膜蛋白，和III型分泌蛋白等多種蛋白都可能參與了致病過程[6-8]。研究發現Ct與其他革蘭陰性細菌一樣，其外膜也含有大量的糖脂(Lipopolysaccharide，LPS)和脂蛋白。LPS一般是由脂質A、O-抗原和核心區所組成。LPS具有活化補體和刺激機體釋放血管活性物質等作用，在細菌的粘附和侵襲過程中起重要功能[9,10]。細菌LPS的合成途徑十分復雜，如大腸桿菌能利用LpxA(UDP-N-acetylglucosamine acyltransferase，LpxA)蛋白催化O-酰基加入到尿苷5′-二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖，這個催化反應是脂質A合成途徑的第一步[11]。目前衣原體LPS的合成途徑尚缺乏研究，我們在前期擴增得到Ct LpxA基因。本文擬通過基因工程的方法純化得到His-LpxA蛋白，然后將其免疫新西蘭兔，獲得了抗His-LpxA蛋白的血清，為進一步研究Ct LPS的合成途徑提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1菌種、載體和實驗動物

大腸桿菌DH5α、BL21、含LpxA基因的重組質粒pMD18-LpxA，原核表達載體pET28a都由湖北醫藥學院保存，實驗用動物新西蘭兔購自廣東省醫學實驗動物中心。

1.2主要試劑和儀器

膠回收試劑盒、質粒DNA提取試劑盒、ExTaq酶、限制性內切酶NdeⅠ、XhoⅠ和T4 DNA連接酶及均購自大連Takara公司，BCA蛋白定量試劑盒購自北京百泰克公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體購自美國 Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc公司，ECL發光劑購自英國Amersham，弗氏佐劑購自Sigma公司產品。Ni2+層析凝膠購自北京康為世紀生物科技有限公司；冷凍高速離心機(Microfuge 20R)購自美國貝克爾曼；超聲波破碎儀(scientz-950E)購自寧波新芝、超低溫冰箱和PCR儀購自賽默飛世爾公司；半干電轉印儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3引物設計及合成

根據LpxA基因序列，使用primer primer6軟件設計引物，上游引物序列為：5′-CCCATATGACCAACATTCATCCTACA-3′(下劃線為NdeⅠ酶切位點)和下游引物序列為：LpxA-R:5′-TTCTCGAGTTACTAAGACTCAACGAAAGCTCCT- 3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)。

1.4LpxA基因的擴增及回收

以重組質粒pMD18-LpxA為PCR模板，擴增目的基因，PCR程序為：94 ℃，5 min；(94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，1 min)* 35個循環；72 ℃，5 min，然后用瓊脂糖凝膠電泳將PCR產物電泳，回收目的DNA片段。

1.5重組表達質粒的構建

將pET28a空質粒和LpxA基因進行雙酶切，回收。然后使用T4 DNA連接酶將LpxA和pET28a在16 ℃下過夜連接。將連接產物轉化大腸埃希菌DH5α，37 ℃倒置，培養16 h。挑取陽性單菌落到LB液體培養基中培養12 h，提取質粒使用PCR驗證，將PCR呈陽性的細菌送上海生工公司進行測序驗證。

1.6重組蛋白的誘導表達與純化

將pET28a-LpxA轉化大腸埃希菌BL21。第二天挑陽性菌接種到LB培養基培養過夜，然后將其按照1∶100擴接到新LB液體培養基；當細菌長到OD600約為0.6時，加入0.1 mmol/L IPTG到培養液，置于28 ℃培養，誘導細菌表達重組His-LpxA蛋白，培養4 h后收集細菌。利用pH值為7.4的PBS溶液洗滌，然后在冰上進行超聲破碎。使用12 000 r/min離心20 min，取上清加入Ni2+層析凝膠，孵育1 h，然后使用40 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，最后用250 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白并收集，使用SDS-PAGE檢測純化效果。

1.7兔抗His-LpxA蛋白多抗的制備

將純化好的His-LpxA蛋白與完全弗氏佐劑乳化，背部皮下多點注射接種新西蘭兔，每只兔接種200 μg，接種3只。三星期后，將His-LpxA蛋白與弗氏不完全佐劑乳化，然后每只兔背部皮下接種200 μg，進行第二次免疫。第三，四次免疫方法和步驟與第二次相同。同時設置注射生理鹽水組為陰性對照。最后一次免疫2個星期后心臟處死采血，分離血清并將其保存在-20 ℃冰箱備用。

1.8抗血清的特異性和效價檢測

取純化好的His-LpxA進行 SDS-PAGE凝膠電泳，然后以100 V恒電壓將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后，加入致備好的抗血清，4 ℃孵育過夜，洗滌干凈。加入HRP標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，洗滌干凈后加入加底物進行顯色，顯影后觀察結果。

將150 ng的His-LpxA蛋白包被到96孔板，4 ℃包被過夜。加入封閉液封閉2 h。將血清進行1∶40，1∶80，1∶160，1∶320……1∶40 960倍比稀釋，然后每孔加入100 μl，以未免疫血清為陰性對照，同時設置PBS溶液為空白對照。室溫孵育2 h，洗滌干凈后加入1∶1000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG，室溫孵育反應2 h。加入顯色劑顯色，10 min后加入終止液終止反應，并測定其OD450，計算血清效價。

2 結果

2.1表達載體的構建

以pMD18-LpxA為PCR為模板，PCR擴增得到的Ct LpxA基因大小為840 bp(圖1A)，與理論大小相符。將其連接到pET28a載體獲得重組質粒pET28a-LpxA，使用PCR檢測pET28a-LpxA，也得到與LpxA基因理論分子量大小相同的條帶(圖1B)。測序結果顯示其序列與LpxA基因一致，表明成功構建重組質粒pET28a-LpxA。

注:M:Marker; 1,2:LpxA基因擴增產物

2.2His-LpxA蛋白的表達及純化

將重組質粒pET28a-LpxA轉化到大腸桿菌表達菌BL21，培養后使用0.1 mmol/L IPTG誘導His-LpxA融合蛋白表達。電泳后發現與對照相比，重組菌在32.8kDa左右有蛋白表達，與His-LpxA蛋白的理論分子量一致(圖2，泳道2)。經Ni2+層析柱純化得到LpxA蛋白，其純度約為95%(圖2，泳道3)。

注：M：蛋白marker；1：轉化pET28a的誘導產物；2：重組菌BL21/ pET28a-LpxA 的誘導產物：3：經Ni2+層析柱純化后的His-LpxA蛋白

2.3制備的多克隆抗體可識別His-LpxA蛋白如圖3所示，制備的多克隆抗體能夠識別重組His-LpxA蛋白。

圖3 制備的多克隆抗體能識別His-LpxA蛋白

2.4LpxA抗血清效價如圖4所示，使用ELISA測定對照組和免疫組新西蘭兔血清多克隆抗體的滴度，4次免疫后，將實驗組血清血清稀釋10 240倍后為陽性(圖4)，表明獲得血清的滴度大于1∶10 240，成功制備抗血清。

圖4 ELISA檢測LpxA蛋白免疫新西蘭兔后血清

3 討論

LPS是革蘭陰性細菌的毒力因子之一，對大多數的革蘭陰性細菌的活性極為重要，研究發現革蘭陰性細菌中至少有6個基因參與了脂質A的合成，抑制其中任一基因的活性都會導致細菌的死亡[9]。Ct感染能夠導致沙眼和生殖道等多種疾病 近年來研究證實LPS是Ct的EB發育過程中必不可少的成分，如果抑制Ct脂質A合成酶的活性，阻止Ct合成LPS，會導致具有感染活性的EB會失去感染能力[10,12]。LpxA基因是催化合成脂質A的第一個關鍵基因，它能夠將O-?；D移到尿苷5'-二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖?，F在針對細菌的LpxA蛋白開發新型抗生素，LpxA蛋白有望成為控制Ct傳染的靶點之一[11,13,14]。

獲得高純度的LpxA蛋白為研究Ct中脂質A合成途徑提供實驗基礎。His標簽具有分子量小，免疫原性低和與Ni2+親和力高等特點，現在廣泛用于純化外源融合蛋白[15]。本研究將LpxA基因連接到pET28質粒，得到的重組質粒能夠表達含His標簽的融合蛋白。將重組質粒轉化到表達菌大腸桿菌BL21，使用IPTG誘導大腸桿菌表達融合蛋白，然后我們再用Ni2+親和法對純化目的蛋白，得到較好純度的融合蛋白。我們使用純化得到的融合蛋白免疫新西蘭兔，得到抗LpxA蛋白的血清，發現其效價高都于1∶10 240，說明純化得到的融合蛋白能夠誘導新西蘭兔產生高效價的抗體，為進一步研究LpxA蛋白功能提供基礎。