神經生長因子對牙周炎犬即刻種植骨結合影響的實驗研究

張 艷，王 偉，劉 新，袁 琳，劉 聰

(1.吉林大學中日聯誼醫院 口腔科，吉林 長春130033;2.泰安市中心醫院 口腔科，山東 泰安271000)

牙周炎在世界范圍內發病率高達90%，已成為了成年人牙缺失的最主要原因。目前，種植修復是牙缺失患者極為重要的修復方法之一。牙周炎雖然不是口腔種植修復的絕對禁忌癥，但種植失敗風險較高，尤其即刻種植。因此，如何提高牙周炎患者拔牙后即刻種植的成功率是目前研究的熱點。

神經生長因子(NGF)具有促進骨折愈合的能力[1,2]。NGF能促進血管生成，且在不同鈦表面能提高內皮細胞增殖和基因的表達，并有抗炎作用，可能對種植體周圍早期骨結合有一定促進作用[3-6]。但目前鮮有NGF對牙周炎患者拔牙即刻種植早期骨結合影響的文獻報道。為觀察NGF對牙周炎犬即刻種植早期骨愈合的影響，本實驗建立犬前磨牙牙周炎模型，拔牙后行即刻種植術并局部應用NGF，以期為臨床牙周炎即刻種植后局部應用NGF提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4只成年雄性健康比格犬，體健，口腔衛生條件良好，無任何口腔疾病。

1.2 實驗材料

6號絲線、正畸結扎絲、牙周探針、高速渦輪手機、金剛砂車針、牙齦卟啉單胞菌(由吉林大學白求恩醫學部基礎實驗室提供)、韓國Mega種植體(直徑3.3 mm，長7 mm)、注射用鼠NGF(麗康樂)[麗珠集團麗珠制藥廠，珠海，批準文號：國藥準字S20100005]臨用前每瓶用2 ml氯化鈉注射液溶解。

1.3 實驗方法

1.3.1犬牙周炎模型的建立 全身麻醉后，左、右兩側所有前磨牙牙頸部下使用渦輪手機制備一淺溝，正畸結扎絲及事先浸泡過牙齦卟啉單胞菌的6號絲線進行結扎，在飼料中添加全脂奶粉、蔗糖各20 g，并在牙頸部每日涂抹牙齦卟啉單胞菌，每周對犬的牙周進行觀察和探診。觀察指標為：出血指數(bleeding index,BI)、菌斑指數(plaque index,PLI)。第4周末建模完成后，全麻下拆除絲線及結扎絲對犬的全口牙齒進行牙周潔治，并拍攝螺旋CT，三維重建后測量釉牙骨質界到牙槽嵴頂的距離視為牙槽骨吸收量。

1.3.2種植手術及術后處理 第5周，集中一天由一名臨床經驗豐富的種植醫師對4只犬拔牙后行即刻種植術。全麻后，微創拔除左、右側下頜第二、三前磨牙，逐級擴孔，即刻植入Mega種植體16枚，植入扭矩35N.cm以上，可吸收縫線嚴密縫合。術后流質飲食，肌注青霉素鈉48萬U/只/天3天。選擇右側下頜作為對照組，左側下頜即為實驗組。實驗組在種植體周圍骨膜下頰、舌側注射NGF，劑量為1.0 μg/d，注射2周；對照組種植體周圍骨膜頰、舌側注射相同體積的0.9%生理鹽水。術后4、8周各隨機選擇兩只犬用過量麻醉法處死，取含種植體的犬下頜骨標本，生理鹽水沖洗、作好標記后，10%的福爾馬林溶液浸泡備用。

1.4 觀察指標

1.4.1大體觀察 觀察種植術后植體有無松動及周圍軟組織有無感染、炎癥和愈合狀況。

1.4.2X線觀察 對種植體及周圍軟、硬組織行X線檢查，觀察種植體周圍骨密度及結合狀況。

1.4.3組織形態學觀察 將標本放在清水下連續沖洗12 h，不同濃度梯度酒精脫水、包埋，萊卡硬組織切片機切片，磨至厚度約為80 μm的磨片，甲苯胺藍染色，Olympus光學顯微鏡進行種植體-骨整合的觀察。

1.4.4骨計量學分析及數據處理 應用Image-pro plus 6.0對每個植體的骨結合率進行計算，選擇種植體頰側及舌側作為觀察區域。骨結合率為種植體與新生骨組織接觸的長度與種植體在骨界面的長度的比值乘以100%。對所有實驗數據應用SPASS17.0進行處理，并采用單因素方差分析進行比較。當P<0.05時，差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 牙周炎模型及評估

2周后下頜兩側前磨牙的牙齦出現炎癥癥狀：牙齦紅腫充血，探診容易出血，BI為1-3， PLI為1-2。結扎4周后，下頜前磨牙牙頸部可見大量的牙菌斑及軟垢、探及牙石，BI為3-4， PLI為2-3，牙齒松動Ⅰ-Ⅱ度，螺旋CT三維重建顯示下頜前磨牙處的牙槽嵴頂明顯吸收，為牙周炎的臨床表現，提示牙周炎犬動物實驗模型建立成功。對兩組2、4周BI、PLI及4周牙槽骨吸收量進行對比分析(表1)，結果均顯示差異不顯著(P>0.05)。

2.2 大體觀察

術后實驗動物進食、活動正常，均無死亡。手術部位愈合良好，未發生炎癥反應及手術并發癥，未出現植體的松動、脫落，金屬口鏡柄端敲擊種植體頂部聲響清脆。

表1 4周下頜骨兩側第二、三前磨牙牙槽骨吸收量對比

2.3 X線觀察

X線片上未顯示異常骨吸收區域。術后4周，對照組與實驗組植體周圍均顯示有放射性透射區，與實驗組相比，對照組種植體周圍透射區明顯。術后8周，較4周各組種植體周圍區域與正常骨組織更接近，對照組與實驗組相比種植體周圍投射區稍明顯(圖1)。

A：4周對照組；B：4周實驗組；C：8周對照組；D：8周實驗組

2.4 組織形態學觀察

術后4周：對照組植體與骨組織之間有部分結合，較多的纖維結蹄組織形成，可見類骨質，骨小梁比較稀疏；實驗組植體與骨組織之間結合區域相對較多，相對較少的纖維結締組織成分，類骨質開始形成，連續的骨小梁出現。術后8周：兩組種植體周圍骨組織均較4周時更成熟、致密。對照組，新生骨組織較多，骨小梁比較規則；實驗組類骨質礦化程度高，骨小梁均勻整齊，新生骨組織致密，骨組織直接與種植體結合范圍更廣(圖2)。

A：4周對照組；B：4周實驗組；C：8周對照組；D：8周實驗組

2.5 骨計量學分析

術后4、8周：對照組種植體骨結合率明顯低于實驗組，單因素方差分析兩組P均小于0.05，差異具有統計學意義(表2)。

3 討論

牙周炎是由細菌引起的牙周組織的進行性破壞性疾病，伴隨牙周袋形成和炎癥、進行性的附著喪失和牙槽骨的吸收。多種因素影響著牙周炎患者即刻種植的成功，良好的初期穩定性是口腔種植成功的先決條件[7]。研究表明，術后4、8周牙周感染部位的種植相對于健康部位種植骨愈合率低[8]。牙周炎患者拔牙后牙槽窩的形態、局部炎癥及剩余骨量都可能影響植體的初期穩定性，從而增加即刻種植失敗的風險。

表2 術后4、8周后的種植體骨結合率

NGF是具有營養神經元和促進突觸生長功能的一種多胎蛋白，具有骨折愈合的潛能[1,2]。血管的生成對于種植體周圍骨再生和骨結合非常重要，Lazarovici等[3]證明了NGF與血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)一樣具有促進血管生成的能力。Guang等[4]通過實驗研究發現NGF可以促進鈦表面血管形成和基因的表達。王亮等[5]經過對兔股骨種植體周圍NGF的表達研究發現NGF的表達和骨愈合細胞的功能成正比。鮑艷娜等[9]將NGF應用于兔下頜骨種植，發現NGF能縮短骨組織愈合時間，并提高種植體骨結合率。NGF可以提高骨相關蛋白的表達，促進細胞成骨分化，增強牙周成纖維細胞成骨性[10,11]。汪瓊等研究NGF對成骨細胞基因表達的影響發現，NGF可減少NO釋放從而發揮抗炎作用[6]。

良好牙周炎動物實驗模型的建立是至關重要的。犬與人類的牙周組織結構相似，且一生同樣有乳、恒牙兩副牙齒。尤其比格犬性格溫順、大小適宜，常被用于牙周病的動物實驗模型研究[12,13]。建立動物牙周炎實驗模型主要有：結扎法[14]、細菌涂抹法[15]、高塘黏性飲食法[16]等方式。為確保牙周炎犬動物實驗模型的成功建立，本實驗采用了以上3種方法聯合進行造模。4周后所有犬左右兩側下頜前磨牙區均表現出牙齦炎癥、探診出血、牙齒松動及牙槽嵴頂吸收的牙周炎臨床表現，提示造模成功。

本研究成功建立比格犬牙周炎模型后，拔出雙側下頜第二、三前磨牙后行即刻種植，并在種植體周圍局部注射NGF，術后4、8周，x線顯示實驗組種植體周圍透射影均小于對照組，組織形態學顯示實驗組種植體周圍新生骨量明顯高于對照組，骨計量學分析顯示實驗組骨結合率明顯高于對照組，并且差異均具有有統計學意義。NGF局部應用于牙周炎拔牙后即刻種植，同樣可以加速種植體周圍新生骨的生成、促進骨愈合，并提高種植體骨結合率，但其具體機制尚未完全明確，局部應用NGF作為一種牙周炎種植的輔助手段應用于臨床還需進一步研究。