二甲雙胍聯(lián)合卡鉑對(duì)宮頸癌U14細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤研究

盛敏佳,赫東蕓,王立巖,唐莊艷,仝曉麗

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春130033)

據(jù)2015年全球數(shù)據(jù)顯示，在發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌位居女性好發(fā)腫瘤第四位，僅在中國(guó)每年就有13萬(wàn)新發(fā)病例及5萬(wàn)死亡病例[1,2]。順鉑是宮頸癌一線化療藥物的首選。然而，宮頸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此，我們急需解決化療藥物的耐藥性。二甲雙胍是II型糖尿病的一線治療藥物，目前被認(rèn)為具有潛在的抗腫瘤作用，低劑量的二甲雙胍在乳腺癌中能有效抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化并殺傷腫瘤干細(xì)胞，并且二甲雙胍聯(lián)合化療藥物阿霉素能夠共同殺傷腫瘤干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞[3]。在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌及宮頸癌中二甲雙胍可以作為一種抗癌成分來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增生，研究顯示其機(jī)制為直接激活A(yù)MP依賴(lài)的蛋白激酶(AMPK)，之后抑制哺乳動(dòng)物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，從而抑制靶細(xì)胞內(nèi)蛋白的合成及增殖[4,5]。本實(shí)驗(yàn)組體外實(shí)驗(yàn)也已證實(shí)二甲雙胍能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及阻滯細(xì)胞周期G0/G1期來(lái)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，同時(shí)二甲雙胍與卡鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠增強(qiáng)卡鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞的化療敏感性[6]。

為了進(jìn)一步探討二甲雙胍是否可抑制宮頸癌小鼠移植瘤模型腫瘤的生長(zhǎng)，本文通過(guò)建立宮頸癌U14細(xì)胞小鼠皮下移植瘤模型，探討二甲雙胍聯(lián)合卡鉑對(duì)小鼠宮頸癌U14細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源及飼養(yǎng)條件6周齡雌性昆明鼠，20±0.5 g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所動(dòng)物房。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度25℃，濕度40-60%，噪音分貝<60分貝，晝夜明暗交替時(shí)間為12 h/12 h。

1.2宮頸癌U14細(xì)胞小鼠皮下移植瘤模型的構(gòu)建吸取U14腹水型瘤源鼠腹腔中的腹水型瘤細(xì)胞,稀釋成1.6×106個(gè)/ml,于小鼠右側(cè)后腿背側(cè)皮下接種細(xì)胞懸液0.1 ml，接種一周后，對(duì)小鼠成瘤情況進(jìn)行觀察，采用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠皮下腫瘤直徑在6 mm左右時(shí)，認(rèn)定為小鼠移植瘤模型構(gòu)建完成。

1.3實(shí)驗(yàn)分組將宮頸癌U14細(xì)胞小鼠皮下移植瘤模型進(jìn)行隨機(jī)分組，共分為4組，每組9只小鼠：第一組為生理鹽水腹腔注射對(duì)照組，第二組為二甲雙胍腹腔注射組，第三組為卡鉑腹腔注射組，第四組為二甲雙胍聯(lián)合卡鉑腹腔注射組。

1.4各組治療方案小鼠皮下移植瘤模型構(gòu)建完成后，自接種后第8天開(kāi)始分別給予二甲雙胍、卡鉑、二甲雙胍聯(lián)合卡鉑進(jìn)行干預(yù)。腹腔注射二甲雙胍溶液(100/mg/day)，連續(xù)給藥18天；卡鉑50 mg/kg，給藥時(shí)間1天；對(duì)照組小鼠則腹腔注射等量的生理鹽水，給藥時(shí)間為18天。

1.5腫瘤體積及小鼠體重測(cè)量給藥后每2天用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠皮下腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑(mm)，并以此計(jì)算腫瘤體積(V=0.52×長(zhǎng)徑×短徑2)，同時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠體重(g)。

1.6病理組織學(xué)檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將小鼠斷髓處死，將四組瘤體固定在10%甲醛中，制備HE染色切片,鏡下觀察各組腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)變化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；生存分析采用Kaplan-Meier法；P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1宮頸癌U14細(xì)胞株小鼠皮下移植瘤體積的影響

實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，U14實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組腫瘤體積增長(zhǎng)率如圖1所示，生理鹽水對(duì)照組腫瘤體積增長(zhǎng)511.4±24.5%，二甲雙胍組腫瘤體積增長(zhǎng)306.4±37.3%，卡鉑組腫瘤體積211.5±9.98%，二甲雙胍聯(lián)合卡鉑組腫瘤體積40.4±13.4 mm%。生理鹽水腹腔注射組皮下腫瘤體積增長(zhǎng)最快，而二甲雙胍組、卡鉑組腫瘤體積增長(zhǎng)與對(duì)照組比較緩慢，二甲雙胍聯(lián)合卡鉑給藥組能夠顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，與二甲雙胍組，卡鉑組及對(duì)照組相比，均具有極顯著性差異(P<0.01)。

圖1 各組腫瘤體積增長(zhǎng)百分率比較

2.2宮頸癌U14細(xì)胞株小鼠體重的影響

如圖2所示，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每2日監(jiān)測(cè)小鼠體重，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，各組小鼠體重均有所增長(zhǎng)，但各組間比較無(wú)明顯差異，說(shuō)明二甲雙胍聯(lián)合卡鉑腹腔內(nèi)注射治療宮頸癌U14細(xì)胞株荷瘤小鼠時(shí)，當(dāng)給藥劑量后對(duì)小鼠無(wú)毒性反應(yīng)。

2.3宮頸癌U14細(xì)胞株小鼠皮下移植瘤的組織形態(tài)學(xué)特征

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將4組小鼠移植瘤瘤體固定在10%甲醛中，制備HE染色切片,觀察各組腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)變化，對(duì)照組少見(jiàn)癌細(xì)胞凋亡或壞死，呈典型的巨核、異性核；二甲雙胍聯(lián)合卡鉑給藥組可見(jiàn)細(xì)胞松散，多見(jiàn)局灶性壞死，細(xì)胞核深染，呈褐色，另可見(jiàn)細(xì)胞核固縮、溶解、碎裂，染色質(zhì)部分紅染。其余2組癌細(xì)胞異型性及細(xì)胞核裂解、壞死程度介于對(duì)照組和聯(lián)合給藥組之間，綜上所述，二甲雙胍聯(lián)合卡鉑給藥能夠更好的引起腫瘤組織凋亡和壞死。

圖2 各組荷瘤小鼠體重變化比較

圖3 各組荷瘤小鼠移植瘤HE染色結(jié)果

3 討論

宮頸癌是目前女性好發(fā)的腫瘤之一，手術(shù)、放療及化療常常單獨(dú)或聯(lián)合用于治療宮頸癌，但生存率仍然不理想。因此，抑制腫瘤侵襲和遷移的重要策略是重新選定藥物同時(shí)應(yīng)著重考慮提高患者的整體生存質(zhì)量和生活質(zhì)量[7]。由抗癌藥物和不同作用機(jī)制的藥物組成的組合療法可以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，且通常比單一療法更有效[8,9]。最近的流行病學(xué)研究證實(shí)口服二甲雙胍的糖尿病患者其癌癥的發(fā)病率及死亡率均降低[10，11]。越來(lái)越多的體內(nèi)、體外試驗(yàn)也證實(shí)了二甲雙胍對(duì)于多種癌細(xì)胞具有直接的殺傷作用[12]。有研究將二甲雙胍與奈非那韋聯(lián)合作用于宮頸癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩者單獨(dú)作用于宮頸癌HeLa,SiHa和 CaSki 細(xì)胞株時(shí)，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制轉(zhuǎn)移及侵襲作用均較弱，當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用兩種藥物時(shí)，這兩種藥物能夠很好的協(xié)同抑制人宮頸癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)和裸鼠體內(nèi)宮頸癌細(xì)胞異種移植，并抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[13]。

大量證據(jù)證實(shí)二甲雙胍對(duì)婦科腫瘤如卵巢癌等有較好的療效，且能改善內(nèi)皮功能[14]。然而二甲雙胍對(duì)宮頸癌的作用機(jī)制卻很復(fù)雜，了解這些機(jī)制對(duì)于充分利用其抗癌潛力至關(guān)重要。研究顯示二甲雙胍可以抑制PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的表達(dá)，并且能夠?qū)m頸癌具有化療協(xié)同作用，對(duì)多種腫瘤也具有直接及間接的抗腫瘤作用[15]。二甲雙胍能夠拮抗促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、活動(dòng)、侵襲和遷移的特定途徑[16-18]。二甲雙胍能夠通過(guò)降低胰島素樣生長(zhǎng)因子水平，直接激活腺苷單磷酸酶活化蛋白激酶通路，抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，從而降低腫瘤葡萄糖供應(yīng)，起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[19]。二甲雙胍另一種抗腫瘤機(jī)制是能夠抑制MALAT1的表達(dá)并誘導(dǎo)miR-142-3p的表達(dá)，破壞了宮頸癌細(xì)胞核中的MALAT1/miR-142-3p海綿體，導(dǎo)致了miR-142-3p釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與HMGA2 3′UTR結(jié)合，最終抑制了宮頸癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[20]。本實(shí)驗(yàn)組已將二甲雙胍與卡鉑聯(lián)合，應(yīng)用MTT法、AO/EB染色及流式細(xì)胞儀對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞進(jìn)行了體外試驗(yàn)研究，結(jié)果證實(shí)二甲雙胍能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期G0/G1期阻滯來(lái)抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖，同時(shí)二甲雙胍與卡鉑聯(lián)合作用于宮頸癌Hela細(xì)胞，可以增強(qiáng)其體外抑瘤作用[6]。

本實(shí)驗(yàn)將二甲雙胍及卡鉑單獨(dú)及聯(lián)合作用于宮頸癌荷瘤小鼠，結(jié)果證實(shí)二甲雙胍聯(lián)合卡鉑給藥能夠明顯抑制腫瘤體積生長(zhǎng)，且不增加化療藥物毒性反應(yīng)，對(duì)腫瘤的抑制作用顯著優(yōu)于其他各組。綜上所述，二甲雙胍聯(lián)合卡鉑能夠能顯著抑制宮頸癌U14細(xì)胞株小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，二甲雙胍能夠增強(qiáng)卡鉑的化療敏感性。本研究結(jié)果為宮頸癌化療以及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的新藥物治療提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。