欖香烯對人卵巢癌SKOV3細胞株生物學作用機制

關永紅,唐 艷,董全宇,劉賢英

(吉林大學第二醫院,吉林 長春130041)

卵巢癌為三大婦科惡性腫瘤之一。具有發病隱匿，發展迅速，轉移及侵襲能力強，惡性度高的特點[1]。早期診斷率低，大部分患者確診時已是晚期。失去了手術治療的可行性，只能通過輔助治療延長其生存期。近年來隨著腫瘤細胞學的發展和大量靶向藥物的臨床應用。從細胞學水平預測治療方式的有效性和藥物敏感性不僅成為可能，而且成為必然趨勢[2]因此本研究依SKOV3細胞為靶點，探討其對欖香烯制劑的生物學機制，為卵巢癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料、細胞，藥物及試劑

卵巢癌細胞株(SKOV3)購于中國科學院上海細胞生物研究所；欖香烯注射液由大連金港制藥有限公司生產，細胞培養板，RPMI1640培養基，四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑購于美國sigma公司，胎牛血清購于長春生物制品研究所)

1.2方法

1.2.1細胞培養、分組與給藥 人卵巢癌SKOV3細胞株經復蘇后置于含有10%胎牛血清的1640培養基內于37°C 5%二氧化碳培養箱內靜止培養，取對數生長期的SKOV3細胞進行下一步實驗。0.25%胰蛋白酶消化，調整細胞數為5×104/ml，加入96孔塑料培養板內每孔100 μl/孔分為空白對照組、實驗組(欖香烯濃度為100,200,400 μg/ml)

1.2.2細胞增殖抑制率檢測(MTT試驗) 取96孔培養板內生長良好SKOV3細胞分組，空白對照組，只加入100 μl細胞維持液，共10復孔，實驗組分別加入由細胞維持液配制的不同濃度的欖香烯溶液，每個濃度10復孔，于5%二氧化碳培養箱內靜止培養，結束前4小時每孔內分別加入MTT試劑20 μl，繼續培養4 h后，棄去上清液，每孔內分別加入二甲基亞砜(DMSO)200 μl震蕩10 min，應用酶標儀于570 nm處測定吸光度A值，計算各組細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=[1-(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100%，結果見表1。

表1 不同濃度欖香烯制劑對SKOV3細胞增殖抑制率

1.2.3SKOV3細胞周期進程及凋亡率檢測 細胞培養及分組同1.2.2，不同之處是將96孔培養板改為25 ml培養瓶進行。每個濃度5瓶培養結束后，收集細胞，PBS(磷酸鹽緩沖液)洗3次。70%乙醇固定，置4℃冰箱內48 h后取出離心1 000 r/5 min，碘化丙啶漂色，避光孵育30 min，然后通過流式細胞儀檢測，采用CELL QUEST軟件分析各組細胞周期各時相變化及凋亡率，結果見表2。

1.2.4透射電子顯微鏡觀察 細胞培養及分組同1.2.3 實驗結束后分別收集經不同濃度欖香烯制劑作用后的SKOV3細胞懸液于錐型離心管內離心沉淀1 000 r/10 min，棄去上清，細胞沉淀物經2.5%戌二醛前固定。1%鋨酸后固定，梯度酒精脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛一鈾雙重染色，透射電子顯微鏡觀察。

2 結果

2.1MTT結果不同濃度的欖香烯制劑對 SKOV3細胞增殖均有抑制作用，且呈劑量依賴性，與對照組相比差異有統計學意義P<0.01。

2.2流式細胞儀結果不同濃度的欖香烯制劑作用于SKOV3細胞后G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M細胞相對增多，細胞凋亡率升高，組間比較有統計學意義，提示欖香烯制劑能夠阻滯SKOV3細胞周期進程改變，及誘導細胞凋亡率增高。

表2 不同濃度欖香烯制劑對SKOV3細胞周期進程改變及凋亡率

2.3透射電子顯微鏡結果不同濃度欖香烯制劑作用SKOV3細胞后，細胞膜破裂，線粒體腫脹，細胞核染色質凝集，可見凋亡小體改變，微管，微絲斷裂，胞漿內有空泡形成，見圖1-3。

圖1 100μg/ml欖香烯對SKOV3細胞 改變，線粒體腫脹，有空泡形成5000×圖2 200 μg/ml欖香烯對SKOV3細胞改變，細胞膜破裂，核染體凝集5000×圖3 400 μg/ml欖香烯對SKOV3細胞改變，細胞核破碎，可見凋亡小體5000×

3 討論

卵巢癌早期診斷困難單純手術切除治愈率較低，目前采取手術為主.放療化療為輔的綜合治療。然而.由于傳統的化療藥物存在不同程度的不良反應.在損傷腫瘤細胞的同時對正常器官和組織也有明顯的損傷。因此、尋找不良反應小或無不良反應的藥物成為目前卵巢癌治療的新熱點。欖香烯是從草本植物中藥莪術中提取的一種揮發油類物質[3]，研究證明該物質具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂.抗突變等多種生物學作用.而且毒副作用小，獲取方便，廣泛用于呼吸系統、消化系統、婦科系統腫瘤的治療、尤其是腫瘤所致的胸腔、腹腔積液.治療效果顯著。因此，本研究應用欖香烯制劑，體外觀察對SKOV3細胞增殖抑制作用及細胞周期進程，細胞凋亡及亞細胞結構改變。MTT.結果表明，不同濃度的欖香烯制劑對SKOV3細胞的增殖抑制作用均獲得了較為滿意結果，抑制率分別為16.2% 37.8%和45.6.%與對照組相比，差異有統計學意義。P<0.01。MTT 試劑可被哺乳動物活細胞線粒體中的脫氫酶吸收，將MTT試劑還原成藍色甲臜顆粒。且甲臜生成量與活細胞數及細胞活化狀態呈線性關系。因此MTT試驗被廣泛用于抗腫瘤藥物篩選和細胞毒性試驗研究。具有一定的客觀性。

流式細胞術結果顯示，不同濃度的欖香烯制劑對SKOV3細胞增殖周期各時相均有不同程度的抑制作用，細胞周期是一個高度保守備受各種細胞因子嚴格控制[4].任何一個環節失控即可發生功能和形態學改變，欖香烯誘導SKOV3細胞具有一定的濃度依賴性、均表現出G0/G1期細胞增多。S期細胞減少。從而使G2/M期細胞相對增多，而G2/M期細胞增多是細胞損傷的普遍反應，這一現象從細胞凋亡率得到了證實。凋亡率分別為9.6%，16.9%和19.2%。文獻報道[5]。在腫瘤治療中，細胞周期阻滯對于減緩腫瘤的生長.提高治療的效率尤為重要。由于腫瘤細胞多發生P53基因突變從而缺泛G1期檢查點、而G1期檢查點是各種化學藥物作用的敏感點。欖香烯制劑恰巧使skov3細胞G1期檢查點阻滯.從而使腫瘤細胞增長變緩。不能進入S期。G2/M期作為細胞進入有絲分裂之前的最后一道關卡、多種治療手段都會使腫瘤細胞具有選擇性停止該期[6]且有作為新型腫瘤治療靶點的可能性。

此外.本研究還應用透射電子顯微鏡觀察經不同濃度的欖香烯制劑作用后的SKOV3細胞亞細胞結構改變.細胞器線粒體腫脹，有空泡形成.核染色質趨邊凝集.紡錘體斷裂.可見凋亡小體改變。

綜上所述.欖香烯誘導SKOV3細胞具有一定的濃度依賴性、因此、研究細胞周期阻滯機制不僅對基礎細胞生物學有重要的理論價值，也對預防和治療腫瘤有重要的指導意義。為了提高欖香烯的抗癌效果，同時減輕不良反應，探索新的藥物劑型、在降低毒性的基礎上，通過增加劑量、延長作用時間，以期達到提高療效及臨床順應性的目的。