孕酮對奶牛子宮內膜上皮細胞信號通路的影響

黃霞，林家琪，李建基，王亨，崔璐瑩

（揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009）

孕酮作為一種類固醇激素，對雌性動物的生殖活動起著重要的調控作用[1]。目前大量研究發現，產后子宮內膜炎的發生與奶牛體內的孕酮水平有密切聯系[2]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在炎癥反應中具有重要作用，孕酮對奶牛子宮內膜細胞MAPK信號通路的影響目前尚無報道。故本試驗開展了孕酮對奶牛子宮內膜上皮細胞MAPK信號通路的影響研究，通過采用與奶牛產后相似濃度的孕酮處理原代培養的奶牛子宮內膜上皮細胞，來檢測MAPK信號通路（ERK、JNK和P38）的磷酸化情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 奶牛子宮角 奶牛子宮取自揚州屠宰場，無菌采集未孕健康奶牛的子宮，盡快送往實驗室。

1.1.2 主要試劑與儀器 試劑：DMEM/F12培養基、孕酮（Sigma，美國）；無內毒素胎牛血清（四季青，中國）；蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液（北京普利萊基因技術有限公司）；兔抗鼠Phospho-p38 MAPK，Phospho-p44/p42 MAPK（ERK1/2），Phospho-SAPK/JNK，β-actin一抗和山羊抗兔二抗（CST，美國）。儀器：PVDF膜（Millipore，德國）；二氧化碳培養箱（Thermo，美國）；超純水系統（Millipore，美國）；紫外分光光度計（Thermo公司，美國）；蛋白電泳系統（BIO-RAD公司，美國）等。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞培養和細胞傳代 無菌采集子宮，帶回實驗室。在超凈工作臺內切下子宮角，用預冷的含有5%雙抗的PBS反復沖洗3次，至液體澄清，于4℃靜置30min，然后將子宮角縱向剖開，修剪為約3×3 cm2的小塊，放入50 mL無菌離心管中，加入0.1%鏈蛋白酶，至完全浸沒子宮角組織，于4℃消化16～20h。取出子宮角，用滅菌手術刀輕輕刮取子宮角內膜，放置于PBS中重懸，1200r/min離心5min，棄去上清液，再加PBS重懸，離心，重復3次。然后加入DMEM/F12完全培養基，吹打成細胞懸液，在37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養，每天換一次細胞培養液，3～4d即可獲得原代細胞。采用胰蛋白酶消化法進行上皮細胞傳代培養，于37℃、5%CO2飽和濕度下培養，每天換一次細胞培養液，約3 d即可獲得傳代培養細胞[3]。

1.2.2 CCK-8法檢測不同濃度孕酮對奶牛子宮內膜上皮細胞活性的影響 將細胞按103cells/孔濃度接種到96孔細胞板內，待細胞 80%以上匯合后更換含不同濃度（0、1、3、5、10、20ng/mL）孕酮的培養基繼續培養24h；用PBS洗滌，每孔3次；再向每孔加入10μL CCK-8和100μL基礎培養基預混液，繼續放入培養箱內孵育4h，在波長490nm處檢測吸光度。每個時間點分組設置6個重復，以時間為橫坐標、細胞存活率為縱坐標繪制曲線。

1.2.3 Western blot法檢測MAPK信號通路關鍵蛋白的表達量 將細胞按106cells/孔濃度接種到六孔細胞板內，待80%以上細胞匯合后用PBS清洗，更換含不同濃度孕酮（0、1、3、5ng/mL）的基礎培養基繼續培養30min，收集細胞。將細胞經胰酶消化處理后，加入適量的細胞裂解液提取總蛋白，用BCA法測定蛋白質濃度。每組統一上樣20μg/孔，將分裝好的蛋白樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳1.5h。采用半干法將所需蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂乳封閉1h。使用1∶1000稀釋的β-actin一抗孵育PVDF膜，4℃過夜。清洗后，將PVDF膜轉移到含有兔抗鼠HRP偶聯IgG二抗的封閉液中（1∶10000稀釋），室溫孵育1h。使用DAB顯色試劑盒顯影，并用化學發光成像系統采集圖像，根據得到的圖像數據對試驗結果進行分析。

1.2.4 數據處理 試驗數據采用SPSS 18.0軟件中的One-way ANOVA和Duncan法進行統計分析，結果以M±S表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果分析

2.1 不同濃度孕酮對奶牛子宮內膜上皮細胞活性的影響 子宮內膜上皮細胞經不同濃度（0、1、3、5、10、20ng/mL）孕酮處理24h后，用CCK-8法檢測此時子宮內膜上皮細胞的活性，結果如圖1所示。與空白對照組相比，1、3、5、10、20ng/mL 濃度的孕酮未對細胞活性產生影響，且20ng/mL濃度范圍內的孕酮對奶牛子宮內膜上皮細胞無毒性作用。

圖1 孕酮對奶牛子宮內膜上皮細胞活性的影響

2.2 不同濃度孕酮對奶牛子宮內膜上皮細胞MAPK信號通路的影響 奶牛子宮內膜上皮細胞經不同濃度（0、1、3、5 ng/mL）孕酮處理 30 min 后，用Western blot法檢測ERK、JNK、P38和p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白的表達水平，結果如圖2所示。與空白對照組相比，孕酮并未對子宮內膜上皮細胞ERK、JNK和P38的磷酸化產生顯著作用，且不同濃度孕酮之間也沒有顯著差異。

圖2 不同濃度孕酮對奶牛子宮內膜上皮細胞 MAPK蛋白表達的影響

3 討論

孕酮是一種重要的生殖激素，對維持妊娠有重要作用。研究發現，在母牛發情周期中，卵泡期的血漿孕酮一直處于一個較低水平；排卵后，由于顆粒細胞在卵泡刺激素作用下黃體化，孕酮分泌增加[4]。在母牛的發情周期中，發情當天孕酮含量最低，為0.37±0.97 ng/mL，一直持續到發情后第3 d（均低于1ng/mL），從第4d起孕酮水平升高至1ng/mL以上，到第15d時達到最高值3.9±2.22ng/mL[5]。由于產后孕酮水平會出現急劇下降[6]，所以，我們選擇了與發情周期相似的孕酮濃度來作用于子宮上皮細胞，以更好地模擬體內環境。

研究發現，孕酮的許多功能都是通過與作為配體轉錄因子的孕酮受體（PGR）結合來介導的[1]。最近發現的PGR激活轉錄的機制是通過激活Src/Ras/Raf絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號級聯能力來實現的。這表明PGR不僅能夠作為轉錄因子起作用，而且可以直接激活細胞質中的信號傳導途徑[7]。本試驗探究的MAPK信號通路是哺乳動物細胞中關鍵的信號轉導系統之一，參與介導生長、發育、分裂、分化、死亡以及細胞間的功能同步等多種細胞過程[8]。其中，ERK、JNK和P38信號通路經炎癥因子刺激活化后，對炎癥起著重要的調控作用。國外學者發現孕酮可通過抑制MAPK活化，下調對LPS誘導的小膠質細胞TNF-α、iNOS和COX-2的表達，且該下調作用具有劑量依賴性[9]。這些都提示孕酮有著很好的抗炎效應。孕酮對奶牛子宮內膜上皮細胞MAPK信號通路的直接作用尚無報道，故我們選擇與奶牛體內環境相似濃度的孕酮直接作用于經體外純化培養的子宮內膜上皮細胞，通過細胞活性試驗和Western blot法來進行檢測。結果表明，經孕酮處理的子宮內膜上皮細胞活性并未因濃度的升高而產生較大變化；經不同濃度孕酮處理30 min后，MAPK信號通路中的ERK、JNK、P38的磷酸化情況也基本沒有明顯差異。由此我們得出結論，外源性的孕酮對奶牛子宮內膜上皮細胞的MAPK信號通路沒有顯著影響，不能通過孕酮來直接抑制MAPK的活化起抗炎效應。這個結果與Saut JPE得出的“卵巢類固醇對牛子宮內膜固有免疫相關的炎癥反應影響不大”的結論相一致[10]，具有可靠性。