低溫反硝化細(xì)菌的篩選及初步應(yīng)用

鄭雅元肖海燕 王祥河 許勤虎 劉 然

（天津市工業(yè)微生物研究所有限公司，天津 300457）

從廢水中去除氮是控制水污染、修復(fù)水質(zhì)的最重要手段之一。隨著我國(guó)城市化進(jìn)程加快、生產(chǎn)生活迅速發(fā)展，生活污水和工業(yè)廢水排放量日益增多，氮素的治理工作越來(lái)越受到重視。在廢水脫氮的眾多方法中，生物脫氮技術(shù)因其綠色環(huán)保、行之有效等特點(diǎn)受到廣大研究者的關(guān)注。生物脫氮是以反硝化細(xì)菌為主，在兼性厭氧條件下，將硝酸鹽及亞硝酸鹽作為電子受體進(jìn)而生成氮?dú)獾倪^(guò)程。

秋冬時(shí)節(jié)氣溫條件低，此時(shí)微生物生長(zhǎng)活動(dòng)受到抑制，導(dǎo)致生物脫氮效果不理想。有研究報(bào)道稱，當(dāng)溫度條件在10℃以下時(shí)，硝化和反硝化進(jìn)程會(huì)受到強(qiáng)烈抑制。目前國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道生物脫氮技術(shù)的溫度一般在30℃左右，涉及到低溫條件的研究比較少見。因此，從環(huán)境中分離篩選出能在較低溫度下生長(zhǎng)、具有高效反硝化細(xì)菌菌株成為強(qiáng)化生物脫氮技術(shù)的關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 材料

污泥樣品采自天津某污水處理廠；試驗(yàn)用污水取自天津某調(diào)味料廠豆制品加工車間。

富集培養(yǎng)基：CH3COONa，2 g；KH2PO4，0.4 g；MgSO4·7H2O，0.6 g；CaCl·2H2O，0.07 g；KNO3，1 g；Tris緩沖液12mL；微量元素2mL；蒸餾水，1000mL；pH 7.0～7.2；121℃，滅菌 20min。

初篩培養(yǎng)基（BTB選擇性培養(yǎng)基）：KNO3，1 g；KH2PO4，1 g；FeCl2·6H2O，0.5 g；CaCl2·7H2O，0.2 g；MgSO4·7H2O，1 g；琥珀酸鈉，8.5 g；瓊脂，20 g；BTB（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%溴百里酚藍(lán)溶于無(wú)水乙醇），1mL；蒸餾水，1 000mL；pH 7.0；121℃，滅菌20min。

復(fù)篩培養(yǎng)基：乙酸鈉，4.72 g；KNO3，0.075 g；KH2PO4， 1.5 g； Na2HPO4， 0.42 g； MgSO4·7H2O，0.1 g；蒸餾水，1 000mL；pH 7.2；121℃，滅菌20min。

需氧性及運(yùn)動(dòng)性測(cè)定培養(yǎng)基：蛋白胨，10 g；酵母膏，5 g；葡萄糖，1 g；瓊脂，15 g；蒸餾水，1 000mL；pH自然；115℃，滅菌15min。

保藏培養(yǎng)基：可溶性淀粉，2 g；NH4Cl，0.5 g；NaCl，0.5 g；MgSO4·7H2O，0.01 g；FeSO4·7H2O，0.01 g；K2HPO4，0.2 g；蒸餾水，1 000 mL；pH 7.2；121℃，滅菌20min。

LB培養(yǎng)基：牛肉膏，3 g；蛋白胨，10 g；Na-Cl，5 g；蒸餾水，1 000mL；pH 7.2；瓊脂，20 g；121℃，滅菌20min。

1.2 微低溫反硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)

將污泥樣品混合均勻，稱取1 g置于500mL三角瓶中，加入400mL富集培養(yǎng)基，形成深層培養(yǎng)的缺氧環(huán)境，在22℃條件下慢速恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液20mL至400mL新鮮富集培養(yǎng)基中，以2℃為梯度降低培養(yǎng)溫度，如此反復(fù)3次。

1.3 微低溫反硝化細(xì)菌的初篩、純化

將多次富集培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于初篩培養(yǎng)基（BTB選擇性培養(yǎng)基） 上，置于16℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d～3 d，選擇菌落周圍出現(xiàn)藍(lán)色暈環(huán)的單菌落，在新的BTB平板培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線，重復(fù)3～5次，獲得純化的反硝化菌株，涂布于LB培養(yǎng)基上無(wú)雜菌生長(zhǎng)，接種于保藏培養(yǎng)基斜面上，編號(hào)，16℃培養(yǎng)1 d，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 微低溫反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將保藏培養(yǎng)基斜面上的菌種用接種環(huán)挑取一環(huán)接入復(fù)篩液體培養(yǎng)基中，于20℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d，每隔12 h測(cè)定各培養(yǎng)液的OD600值，制作各細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。

1.5 微低溫反硝化細(xì)菌的復(fù)篩

分別將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液轉(zhuǎn)接到復(fù)篩培養(yǎng)基中，以不接菌為對(duì)照組，于20℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每24 h分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組復(fù)篩培養(yǎng)基中總氧化氮、總氮、細(xì)菌OD600及離心除菌后培養(yǎng)液中的總氮含量。

用以下公式計(jì)算總氧化氮和總氮的去除率：

式中：R——復(fù)篩培養(yǎng)基中總氮（總氧化氮）的去除率；

T1——復(fù)篩培養(yǎng)基中總氮（總氧化氮） 的初始質(zhì)量濃度，mg/L；

T2——復(fù)篩培養(yǎng)基中總氮（總氧化氮） 的最終質(zhì)量濃度，mg/L。

生物量氮通過(guò)氮平衡計(jì)算獲得，其公式為：

式中：T——生物量氮mg/L；

T2——反硝化培養(yǎng)基中總氮的終質(zhì)量濃度，mg/L；

T3——通過(guò)離心去除菌體后培養(yǎng)液中總氮的終質(zhì)量濃度，mg/L。

1.6 微低溫反硝化細(xì)菌的耐冷試驗(yàn)

將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mn-5菌株懸液轉(zhuǎn)接到新的復(fù)篩培養(yǎng)基中，于16℃條件下慢速振蕩培養(yǎng)3 d，檢測(cè)總氮的去除率。

1.7 革蘭氏染色

對(duì)mn-5菌株進(jìn)行革蘭氏染色，確定其是屬于革蘭氏陰性菌（G-），還是革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）。

1.8 需氧性及運(yùn)動(dòng)性測(cè)定

將需氧性測(cè)定培養(yǎng)基分裝入試管，滅菌后取出冷至凝固，將試管倒置，用接種針蘸取少量菌苔，自固體深層培養(yǎng)基表面的中心點(diǎn)垂直穿刺，直到接近培養(yǎng)基底部，然后輕輕退出，保持接種線整齊。于20℃培養(yǎng)1 d，觀察細(xì)菌沿穿刺線的生長(zhǎng)情況。

需氧性判定依據(jù)：專性好氧菌只生長(zhǎng)在培養(yǎng)基表面；專性厭氧菌只生長(zhǎng)在培養(yǎng)基底部；兼性厭氧菌生長(zhǎng)在培養(yǎng)基表面及整個(gè)穿刺線；微好氧菌生長(zhǎng)在培養(yǎng)基的中上部，約接近表面4mm處。運(yùn)動(dòng)能力判定依據(jù)：具有運(yùn)動(dòng)能力的細(xì)菌經(jīng)穿刺培養(yǎng)后可沿著穿刺線向外運(yùn)動(dòng)生長(zhǎng)，形成較粗的細(xì)菌生長(zhǎng)線，且邊緣不整齊；不能運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌僅能沿穿刺線生長(zhǎng)，形成細(xì)而整齊的生長(zhǎng)線。

1.9 污水處理的初步應(yīng)用

把篩選出的mn-5菌株按接種量0.5 g/100g接入含污泥的豆制品加工廢水中，以不接種的廢水為空白對(duì)照，在16℃條件下培養(yǎng)5 d，測(cè)定廢水中的總氮含量。

1.10 試驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)方法

試驗(yàn)采用的檢測(cè)方法見表1。

表1 試驗(yàn)主要指標(biāo)檢測(cè)方法一覽表

2 結(jié)果與討論

2.1 微低溫反硝化細(xì)菌的初篩

采用先富集、后選擇性培養(yǎng)的方法進(jìn)行菌種的分離和純化，試驗(yàn)中通過(guò)肉眼觀察，共挑選出10株菌株，經(jīng)過(guò)平板劃線對(duì)比發(fā)現(xiàn)，菌株按其生長(zhǎng)速度可大致分為三類。一類，1號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、10號(hào)共4株菌，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，培養(yǎng)2 d～3 d即能長(zhǎng)出顯著菌落，且易于轉(zhuǎn)移至斜面培養(yǎng)基保存；二類，2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、8號(hào)共4株菌，長(zhǎng)勢(shì)較慢，培養(yǎng)5 d左右長(zhǎng)出明顯菌落，盡管不如一類菌株長(zhǎng)勢(shì)旺盛，但菌落特征顯著；三類，6號(hào)、9號(hào)共2支菌株，長(zhǎng)勢(shì)較慢，培養(yǎng)7 d后尚見細(xì)微菌落出現(xiàn)。將各菌株分別編號(hào)為mn-1～mn-10，培養(yǎng)過(guò)程中觀察并記錄了各個(gè)菌株的形態(tài)特征，結(jié)果見表2。

2.2 微低溫反硝化細(xì)菌的復(fù)篩

當(dāng)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，其個(gè)體形態(tài)與生理特性都比較穩(wěn)定，因此將純化后的單菌落接于復(fù)篩培養(yǎng)基中，測(cè)定各菌株的OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線，以確定各菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，結(jié)果如圖1所示。將純化后的10株菌株分別接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，以未接種的三角瓶為空白對(duì)照，進(jìn)行篩選。通過(guò)測(cè)定濾液中硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、總氮及離心去除菌體后的總氮濃度變化，從而確定各菌株的脫氮能力。培養(yǎng)3 d后各菌株對(duì)培養(yǎng)基中氮含量的降解情況如下頁(yè)表3所示。

圖1 10株反硝化菌株的生長(zhǎng)曲線

表2 反硝化菌初篩菌株菌落形態(tài)表

由表3可以看出，培養(yǎng)3 d后，各組的硝態(tài)氮含量均出現(xiàn)了不同程度的降低，說(shuō)明分離出的菌株普遍具有硝酸鹽還原能力。測(cè)定結(jié)果顯示硝態(tài)氮去除率大于50%的菌株有7株，其中mn-1和mn-5達(dá)到85%以上。然而隨著硝酸鹽的分解，亞硝酸鹽開始積累。硝態(tài)氮的去除表明了菌株還原硝酸鹽的能力，但亞硝態(tài)氮的累積，又說(shuō)明某些菌株僅具有將NO3-初步還原為NO2-的能力，但無(wú)法進(jìn)行或尚未進(jìn)行進(jìn)一步的還原反應(yīng)，導(dǎo)致不能從反應(yīng)體系中徹底脫氮。通過(guò)對(duì)比可以看出，菌株mn-1將硝態(tài)氮幾乎全部還原，但是還原產(chǎn)物大部分以亞硝態(tài)氮的形式存在，該菌株對(duì)亞硝態(tài)氮還原能力的缺失導(dǎo)致其總氧化氮去除率僅為3.6%。脫氮能力甚微。而菌株mn-5不僅硝態(tài)氮的去除率高，亞硝態(tài)氮的含量也沒(méi)有積累，表明對(duì)氮的去除比較完全，應(yīng)具有完整的反硝化酶系，從而表現(xiàn)出了較強(qiáng)的脫氮能力。

通過(guò)氮平衡的方法計(jì)算出了菌體生長(zhǎng)所合成的生物量氮含量，見表4。

表3 培養(yǎng)基中硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的含量變化

表4 培養(yǎng)基中總氮的含量變化

由表4可以看出，培養(yǎng)3 d后，菌株mn-5的總氮去除率為48.5%，生物量氮合成量為3.25mg/L。

對(duì)篩選出的菌株mn-5進(jìn)行鏡檢，菌體兩端鈍圓，確定為革蘭氏陰性短桿菌見圖2。

2.3 菌株mn-5的耐冷試驗(yàn)

mn-5菌株在16℃條件下，3 d內(nèi)總氮去除率為42.3%，與該菌在20℃條件下除氮相比效果有所下降，生物量氮的合成量也有所降低（3.01mg/L），可能是低溫使細(xì)菌生長(zhǎng)速率減慢造成的。

圖2 菌株mn-5革蘭氏染色照片

2.4 菌株mn-5處理污水的初步應(yīng)用

把菌株mn-5接入含污泥的豆制品加工廢水中，以不接種的廢水為空白對(duì)照，在16℃條件下培養(yǎng)5 d，測(cè)得廢水中的總氮含量變化結(jié)果見圖3。

圖3 菌株mn-5對(duì)污水中總氮的去除效果

由圖3可以看出，空白對(duì)照組總氮去除率為10.1%，試驗(yàn)組的去除率為13.3%，提高了3%左右，與空白對(duì)照組相比其增長(zhǎng)率為31.7%。在處理污水的實(shí)際應(yīng)用中，菌種對(duì)總氮的去除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到篩選菌種時(shí)的40%以上，究其原因可能是由于篩選用培養(yǎng)基是以無(wú)機(jī)小分子成分為主，而豆類污水是以有機(jī)大分子為主，兩者在物質(zhì)組成上有很大的不同，菌種對(duì)污水環(huán)境中的大分子有機(jī)物不適應(yīng)導(dǎo)致，有待于進(jìn)一步深入研究。