HPLC法測(cè)定小麥粉中的間苯二酚

陽(yáng)文武朱澤兵周 濃萬(wàn) 莉*

1（重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶404000）

2（重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶404000）

間苯二酚，也稱雷瑣酚、雷瑣辛，是苯間位兩個(gè)氫被羥基取代后形成的化合物，具有殺菌作用，可用作防腐劑，主要用于橡膠粘合劑、合成樹(shù)脂、染料、分析試劑等方面。間苯二酚具有中等毒性，能刺激皮膚、黏膜，同時(shí)可經(jīng)皮膚迅速吸收，生成高鐵血紅蛋白而引起發(fā)紺、昏睡和致命的腎臟損傷。2017年10月27日，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單中，間苯二酚屬于3類致癌物之一。因間苯二酚有防腐，抗褐變的作用，被用于小麥粉粉或面條粉改良劑中。為規(guī)范生產(chǎn)行為，加強(qiáng)小麥粉質(zhì)量安全監(jiān)管，2017年底，食藥監(jiān)局發(fā)布《進(jìn)一步加強(qiáng)小麥粉質(zhì)量安全監(jiān)管的公告》。《公告》要求，嚴(yán)禁生產(chǎn)企業(yè)在小麥粉中添加過(guò)氧化苯甲酰、次磷酸鈉、硫脲、間苯二酚、過(guò)硫酸鹽、噻二唑、曲酸等非食品原料。國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道的間苯二酚檢測(cè)方法主要有滴定法、紫外分光光度法、高效液相色譜方法，滴定法主要用于間苯二酚原料藥的測(cè)定；紫外分光光度法準(zhǔn)確度低、靈敏度低；高效液相色譜法主要用于化妝品、藥品中間苯二酚的測(cè)定。本文采用高效液相色譜法檢測(cè)小麥粉中的間苯二酚，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度、精密度好，靈敏度高，完全能夠滿足于檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)日常檢測(cè)任務(wù)的要求。

1 儀器與試劑

Agilent1260型高效液相色譜儀，KH-2000DB超聲清洗機(jī)，Sartorius萬(wàn)分之一電子分析天平（QUINTIX224-1CN），間苯二酚對(duì)照品（購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，編號(hào)為BZJ001-1502、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%），甲醇、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

2.1.1間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

精密稱取間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品0.098 98 g（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%） 于100 mL容量瓶中，用體積濃度20%甲醇溶液溶解并定容至刻度，得質(zhì)量濃度為979.9μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，貯存于4℃冰箱中，避光保存。

2.1.2 間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)中間液

吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0mL于100mL容量瓶中，用體積濃度20%甲醇溶液定容至刻度，得質(zhì)量濃度為9.799μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，貯存于4℃冰箱中，避光保存。

2.1.3 間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)系列工作液

分別準(zhǔn)確吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)中間液，用體積濃度20%甲醇溶液將其稀釋成間苯二酚含量分別 為 0.245 μg/mL、 0.490 μg/mL、 2.450 μg/mL、4.900μg/mL、9.799μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。臨用時(shí)配制。

2.2 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取混合均勻的試樣1 g（精確到0.001 g）于50mL具塞比色管中，加入體積濃度20%甲醇溶液35mL，渦旋分散均勻，超聲處理（功率300W，頻率40 kHz） 20 min，冷卻至室溫后，用體積濃度20%甲醇溶液定容至50 mL刻度線，混勻，靜置5 min，取適量上清液過(guò)0.22μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：DiamonsilC18（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相：甲醇－體積濃度0.1%甲酸溶液（體積比20∶80），流速 1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)274 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量：20μL。在上述色譜條件下，間苯二酚的保留時(shí)間為8.921min，且色譜峰分離度良好，色譜圖見(jiàn)下頁(yè)圖1、圖2、圖3。

2.4 檢出限

按GB/T16631-2008《高效液相色譜法通則》以3倍信噪比計(jì)算最低檢測(cè)限為10mg/kg。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液20μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定成分峰面積。結(jié)果間苯二酚峰面積的RSD為0.66%。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量（未檢出間苯二酚）的小麥粉9份，每份約1 g，以3份為一組，每組分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1.0mL、3.0mL、10mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 小麥粉中間苯二酚加樣回收率結(jié)果

每組的平均回收率分別為96.4%、99.2%、99.1%，RSD分別為0.25%、0.18%、0.10%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一加標(biāo)試樣溶液分別在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果間苯二酚峰面積的RSD為0.72%，說(shuō)明加標(biāo)試樣溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 對(duì)照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

圖3 加標(biāo)回收色譜圖

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇

在供試品溶液制備中，比較了提取溶劑（水、體積濃度20%甲醇、體積濃度50%甲醇），超聲提取時(shí)間（10min、20min、30min），提取溶劑用量 （25mL、35 mL、50 mL） 對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，最終確定了“2.2”項(xiàng)中的方法。

3.2 色譜條件的選擇

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中，比較了甲醇-水、甲醇-0.02mol/L乙酸銨水溶液、甲醇-體積濃度0.1%甲酸水溶液3種流動(dòng)相，同時(shí)比較了不同流速（0.8 mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min） 對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，最終確定了“2.3”項(xiàng)的色譜條件。間苯二酚的最大吸收波長(zhǎng)在274 nm附近，故選擇274 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。