菌酶聯合制備豬血抗氧化低聚肽

安攀宇，肖嵐，何佩蕓，謝巧，黎蘋，黃曉紅

（四川旅游學院食品學院，四川成都610100）

豬血是豬屠宰行業的副產物，我國作為世界養豬大國，豬血資源豐富，但開發利用較落后[1]，不僅浪費了生物資源也造成嚴重的環境污染，因此開發利用豬血蛋白資源受到了廣泛重視。近年來，國內外利用豬血制備抗氧化肽的研究較多，如張鳳英等[2]采用不同的蛋白酶對豬血紅蛋白進行酶解，得出中性蛋白酶酶解豬血紅蛋白得到的產物抗氧化活性最好，還原力為0.432。唐雯倩等[3]利用超聲波輔助胰蛋白酶水解豬血血紅蛋白制備抗氧化肽，DPPH·最高清除率為75.78%。孔卓姝[4]以豬血紅蛋白為原料，研究7種蛋白酶水解制備抗氧化肽的工藝，胃蛋白酶的水解度和還原力最佳，經響應面優化所得酶解液的還原力為2.665。本試驗擬將枯草芽孢桿菌發酵法和堿性蛋白酶酶解法結合，建立一個優化的菌酶聯合制備豬血抗氧化肽的方案，選取7種體外抗氧化活性指標（·OH清除率、·O2-清除率，抑制脂質過氧化能力、還原力、ABTS＋·清除率、DPPH·清除率、總抗氧化力）綜合評價枯草芽孢桿菌發酵、堿性蛋白酶水解、分子量大小對豬血抗氧化低聚肽活性的影響，篩選出豬血抗氧化低聚肽的最佳制備方法，以期獲得活性較高的豬血抗氧化低聚肽，為其在食品添加劑、醫療、保健用品等的開發利用上提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬血：成都伍田食品有限公司；枯草芽孢桿菌（SICC.197.）：四川省微生物資源平臺菌種保藏中心；堿性蛋白酶（酶活力為85.61 U/g）：上海Kayon公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

挑取活化后的枯草芽孢桿菌，接入裝有50 mL液體培養基[5]的錐形瓶中，放在恒溫振蕩培養箱中培養，溫度為35℃，轉速135 r/min，培養12 h，得到種子培養液（1×109cfu/mL）。

1.2 儀器與設備

HHS-8S電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海光地儀器設備有限公司；UV Power紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機：長沙湘儀離心機有限公司；QYC-2102C恒溫振蕩培養箱：上海福瑪實驗設備有限公司；FD-1冷凍干燥機：北京德天佑科技發展有限公司；GZ-150-S生化培養箱：韶關市廣智科技設備有限公司；GM-0.33隔膜真空泵：天津市津騰實驗設備有限公司；超濾管（截留分子量分別為5 000、1 000 Da）：德國Sartorius公司。

1.3 試驗方法[6]

1.3.1 枯草芽孢桿菌發酵豬血工藝的優化

1.3.1.1 單因素試驗

選取發酵時間、底物濃度、枯草芽孢桿菌接種量3個因素進行單因素試驗。

1）發酵時間的確定：在250 mL錐形瓶中配置濃度為70 g/L的豬血液100 mL，121℃，高壓滅菌20 min，接入1∶40（體積比）的種子液，35℃135 r/min的振蕩培養箱中分別培養 48、60、72、84、96 h。

2）底物濃度的確定：在250 mL錐形瓶中分別配置濃度 30、50、70、90、110 g/L 的豬血液 100 mL，121 ℃，高壓滅菌20 min，接入1∶40（體積比）的種子液，35℃，135 r/min的振蕩培養箱中培養60 h。

3）接種量的確定：在250 mL錐形瓶中配置濃度為70 g/L的豬血血液100 mL，121℃，高壓滅菌20 min，按體積比分別接入 1∶100，1∶50，3∶100，1∶25，1∶20 的種子液，35℃，135 r/min的振蕩培養箱中培養60 h。

1.3.1.2 響應面優化試驗

在單因素試驗結果基礎上，以·OH清除率作為響應值，對豬血液態發酵中的發酵底物濃度、發酵時間、枯草芽孢桿菌接種量3個因素進行三因素三水平的Box-Behnken Design（BBD）響應面優化試驗，得出制備豬血抗氧化低聚肽的最佳發酵工藝。

1.3.2 酶解豬血發酵液工藝的優化

1.3.2.1 單因素試驗

將最優條件下制備的豬血發酵解液于6 000 r/min離心15 min得上清液，研究酶解溫度、酶解時間、pH值、酶底比對上清液多肽含量的影響。

1）酶解溫度：100 mL 發酵上清液分別為 45、50、55、60、65℃，pH 9.5，酶底比為250 U/g的條件下酶解3 h。

2）酶解時間：100 mL發酵上清液在55℃，pH9.5，酶底比為 250 U/g的條件下分別酶解 1、2、3、4、5 h。

3）pH值：100 mL發酵上清液在55℃，pH值分別為 9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，酶底比為 250 U/g條件下酶解3 h。

4）酶底比：100mL發酵上清液在 55℃，pH9.5，酶底比分別為 50、150、250、350、450 U/g的條件下酶解 3 h。

1.3.2.2 響應面試驗

根據單因素試驗結果，以酶解時間、pH值、酶解溫度、酶底比為影響因素，多肽含量為響應值，通過四因素三水平的Box-Behnken Design（BBD）響應面試驗設計優化酶解工藝。

1.3.3 超濾制備豬血肽

酶解后的發酵液于4℃，6 000 r/min高速離心20 min，取其上清液，經0.45 μm濾膜過濾，去除菌體及殘渣；采用截留分子量為5、1 kDa的超濾離心管對膜過濾液進行分離（4 000 r/min，10 min），收集各超濾組分冷凍干燥，測定其抗氧化指標的IC50。

1.3.4 相關指標的測定

1.3.4.1 多肽含量的測定

參照陳昌琳[7]的方法，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定上清液蛋白質含量，計為上清液中多肽含量。

1.3.4.2 體外抗氧化活性的測定

·OH清除率測定參照TIAN F等[8]的方法、·O2-清除能力測定參照殷微微等[9]的方法，抑制脂質過氧化能力測定參照Chen Naifu等[10]方法、還原力測定參照劉昭明等[11]的方法、ABTS＋·清除率測定參照潘瑤等的[12]方法、DPPH·清除率測定參照朱夕波等[13]的方法、總抗氧化力測定參照YANG M等[14]的方法。

1.3.4.3 半抑制濃度（IC50）值的測定

將凍干樣品稀釋成不同濃度（試驗點≥5），分別測定其·OH清除率、·O2-清除率、抑制脂質過氧化能力、還原力、ABTS＋·清除率、DPPH·清除率、總抗氧化力。以樣品濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制成圓滑曲線，根據曲線計算IC50值。

2 結果分析

2.1 枯草芽孢桿菌發酵豬血工藝優化的結果

2.1.1 枯草芽孢桿菌發酵豬血單因素試驗結果

發酵時間、底物濃度和接種量對·OH清除率的影響見圖1。

圖1 發酵時間、底物濃度和接種量對·OH清除率的影響Fig.1 The effect of fermentation time，substrate concentration and inoculumssize on·OH scavenging rate

發酵時間對枯草芽孢桿菌發酵上清液·OH清除率的影響，如圖1A所示，發酵上清液·OH清除率呈先升高后下降趨勢，當發酵時間為60 h時達到最高值60.22%，與·OH清除率最低值差異顯著（p＜0.01）。底物濃度對發酵上清液·OH清除率的影響如圖1B所示，發酵上清液·OH清除率隨底物濃度的增加先上升后下降，當底物濃度為50 g/L時達到最高值61.58%，底物濃度對·OH清除率影響顯著（p＜0.05）。接種量對上清液·OH清除率的影響如圖1C所示，發酵上清液·OH清除率隨接種量增加顯著提高（p＜0.05），在接種量達到3∶100（體積比）時達到最高值64.49%，之后再增加接種量，·OH清除率下降。

2.1.2 枯草芽孢桿菌發酵豬血響應面試驗

利用Design Expert軟件對響應面試驗數據進行多元回歸擬合分析，響應面試驗結果見表1。對該模型進行方差分析見表2。

表1 響應面試驗設計及結果Table 1 Design and results of response surface test

表2 方差與顯著性分析Table 2 Analysis of variance and significance test

如表2所示，所選模型的Prob＞F值0.000 9（＜0.01），即為不同處理組間差異極顯著，說明用回歸方程描述各因子與響應值之間的關系時，其應變量與全體自變量之間的線性關系顯著，即該試驗方法可靠。該模型中，A、B、C、AB、AC、B2、C2對發酵上清液·OH 清除率影響顯著，即底物濃度、發酵時間、接種量、底物濃度和發酵時間的交互作用以及底物濃度和接種量的交互作用對發酵上清液的·OH清除率有顯著影響。且影響程度大小為，接種量＞底物濃度＞發酵時間。

該模型失擬項的Prob＞F值為0.684 7（＞0.05），即失擬項差異不顯著，說明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小。該模型擬合度R2=0.949 9，校正擬合度R2=0.885 4表示該模型能夠解釋·OH清除率有94.99%的變化來源于所選變量，說明該模型適合用于研究底物濃度、發酵時間和接種量3個因素的變化對豬血發酵上清液·OH清除率的影響和預測分析。僅總變異約12%不能用此模型來解釋，也能合理地說明校正擬合度R2=0.885 4的變化。信噪比為10.320，大于4，回歸方程擬合度和可信度較高。對表2中數據進行回歸擬合分析，以發酵上清液·OH清除率為響應值（Y），得到各因素對響應置的二次多項回歸方程為：

由方程預測得到最佳發酵條件是底物濃度59.07 g/L，發酵時間 56.4 h，接種量3.22∶100（體積比），此時·OH清除率為78.94%。根據所得的分析數據進行3組重復驗證試驗，此條件下得到豬血發酵上清液·OH清除率為77.48%，測定結果穩定，偏差不大，證明預測結果合理可靠。

通過回歸方程所作出響應面曲面圖及等高線見圖2和圖3。

圖2 底物濃度與發酵時間交互作用對·OH清除率影響的響應曲面圖及等高線圖Fig.2 Response surface map and contour map of the interaction of substrate concentration and fermentation time on·OH scavenging rate

可直觀反映底物濃度與發酵時間交互作用以及底物濃度與接種量對發酵上清液·OH清除率的影響，且響應面曲面坡度較陡，說明交互作用對響應值影響較顯著，與表2結果一致。

如圖3所示，兩因素之間的影響基本呈拋物線型關系，且均有一個極大值點。從圖2和圖3中可以看出，隨著底物濃度的增大，豬血發酵上清液中的·OH清除率逐漸增大；隨著發酵時間的增加，·OH清除率呈現先增大后降低的趨勢。分析其原因，可能是因為隨著發酵延長，由于底物消耗殆盡，因此產生的豬血抗氧化肽含量達到極值后不再增加反而開始降低，因此對于·OH清除率也呈現出相同趨勢。等高線呈圓形說明兩因素交互作用不顯著，呈橢圓或者馬鞍形則表明交互作用顯著，該結果均與回歸模型方差分析表一致。

圖3 底物濃度與接種量交互作用對·OH清除率影響的響應曲面圖及等高線圖Fig.3 Response surface map and contour map of the interaction of substrate concentration and inoculum concentration on·OH scavenging rate

2.2 酶解豬血發酵液工藝優化的結果

2.2.1 酶解豬血發酵液單因素試驗結果

酶解溫度、酶解時間、pH值和酶底比對多肽含量的影響見圖4。

圖4 酶解溫度、酶解時間、pH值和酶底比對多肽含量的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature、enzymatic hydrolysis time、pH and enzyme/substrate on polypeptide content

由圖4A可知，多肽含量隨溫度的增高呈先上升后下降趨勢，當溫度達到65℃時，多肽含量最高2.92mg/mL，溫度對多肽含量的影響不顯著（p>0.05）。由圖4B可知，隨著酶解時間延長多肽含量增加，酶解時間3 h時，多肽含量最高，為3.01 mg/mL，之后隨酶解時間延長，多肽含量降低，酶解時間對多肽含量的影響不顯著（p>0.05）。由圖4C可知，隨著pH值升高多肽含量呈先上升后下降趨勢，pH值為9.5時，多肽含量最高，為3.01 mg/mL，pH值對多肽含量的影響不顯著（p>0.05）。由圖4D可知，多肽含量隨酶底比增加而快速增加，酶底比為350 U/g時，多肽含量達到最高3.42 mg/mL，隨后降低，酶底比對多肽含量的影響不顯著（p>0.05）。

2.2.2 酶解豬血發酵液響應面試驗

在單因素試驗基礎上，采用四因素三水平對酶解液多肽含量進行響應面優化試驗，試驗結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface test

續表3 響應面試驗設計及結果Continue table 3 Design and results of response surface test

表4 方差與顯著性分析Table 4 Analysis of varlance and significance test

如表4所示，所選模型的Prob＞F值＜0.0001，即為不同處理組間差異極顯著，說明用回歸方程描述各因子與響應值之間的關系時，其應變量與全體自變量之間的線性關系顯著，即該試驗方法可靠。該模型中，A、D、AC、BD、A2、B2、C2和 D2對多肽含量影響顯著，即酶解時間、酶底比、酶解時間與酶解溫度、pH值與酶底比的交互作用對酶解液的多肽含量有顯著影響。

該模型失擬項的Prob＞F值為0.079 4（＞0.05），即失擬項差異不顯著，說明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小。該模型擬合度R2=0.975 3，校正擬合度R2=0.950 5表示該模型能夠解釋·OH清除率有97.53%的變化來源于所選變量，說明該模型適合用于研究酶解時間、酶底比、酶解溫度以及pH值4個因素的變化對豬血酶解液的多肽含量的影響和預測分析。僅總變異約5%不能用此模型來解釋，也能合理地說明校正擬合度R2=0.950 5的變化。信噪比20.568，大于4，回歸方程擬合度和可信度較高。

對表4中數據進行回歸擬合分析，以豬血酶解液的多肽含量響應值（Y），得到各因素對響應值的二次多項回歸方程為：

通過多肽含量模型的二元多次回歸方程所作的響應面曲面圖見圖5、圖6，分別表示酶解時間與酶解溫度及pH值與酶底比交互作用對酶解液多肽含量的影響。響應曲面坡度較大，說明響應值對于處理條件較敏感，與表4結果一致。

圖5 酶解時間和酶解溫度交互作用對多肽含量影響的響應曲面圖及等高線圖Fig.5 Response surface map and contour map of the interaction of enzyme Time and enzyme temperature on polypeptide content

圖6 pH值和酶底比交互作用對多肽含量影響的響應曲面圖及等高線圖Fig.6 Response surface map and contour map of the interaction of pH and enzyme/substateon polypeptide content

如圖5所示，兩因素之間的影響基本呈拋物線型關系，且均有一個極大值點。從圖中可以看出，多肽含量隨著酶解溫度的升高和酶解時間的延長呈現出先升高后降低的趨勢。這可能是由于酶解時間過長，溫度升高使多肽水解成氨基酸，導致酶解液多肽含量降低。由圖6可知，多肽含量隨著酶底比和pH值增大而呈現出先升高后降低的趨勢。這可能是因為蛋白酶相對濃度較高時，過堿性環境對蛋白酶活性抑制作用不明顯。

由方程預測得到最佳酶解條件是酶解時間3.16 h，pH 9.48，酶解溫度59.68℃，酶底比387.73 U/g，此時多肽含量為5.473 3 mg/mL。根據所得的分析數據進行3組重復驗證試驗，此條件下得到豬血酶解液中多肽含量為5.481 4 mg/mL，測定結果穩定，偏差不大，證明預測結果合理可靠。

2.3 不同分子量段豬血抗氧化肽體外抗氧化活性比較

豬血抗氧化肽粗提液經5、1 kDa超濾離心管超濾分級后，各分子量段抗氧化肽活性測定結果如表7所示。

表7 不同分子量抗氧化肽體外抗氧化活性的IC50值Table 7 IC50values of antioxidative peptides in different molecular weight

由表7可知，不同分子量段的豬血肽均具有抗氧化的能力，然而對不同的抗氧化指標表現出不同的抗氧化能力；不同分子量段豬血肽的同一抗氧化指標也不相同，分子量在0～1 kDa的肽段的抗氧化指標的IC50最小，說明高活性的豬血抗氧化肽分子量集中在1 kDa以下。

3 結論與討論

3.1 討論

目前，酶解法和發酵法制備活性多肽的工藝比較流行[5]。從本質上講，兩種方法都是利用蛋白酶的酶解作用產生目的肽段，但又各有不足。采用菌酶聯合制備方式，可降低商業酶的使用量[6]，同時彌補微生物發酵水解程度低的不足。本試驗采用菌酶聯合制備豬血抗氧化低聚肽，可使發酵液多肽含量從2.31 mg/mL顯著提高到5.48 mg/mL[1]。

抗氧化肽的抗氧化活性由其相對分子質量、肽段的氨基酸組成序列和空間構造決定。分離純化單一的抗氧化活性肽不僅成本較高，且產量較低，有研究證明低聚肽內部可能發生協同效應[15]，因此，本試驗研究了不同分子量段的豬血低聚肽的抗氧化活性，結果證明0～1 kDa豬血低聚肽的抗氧化活性優于其他分子量段的豬血低聚肽，這與杜欣[6]研究結果相似，可能是因為只有當肽達到適當的分子量時，這些供氫基團才能得到最大的暴露與自由基作用而發揮抗氧化作用[16]，但具體的作用機制與抗氧化活性的關系還有待在后續研究中進一步探討。

3.2 結論

通過單因素試驗和響應面法優化得到菌酶聯合制備豬血抗氧化低聚肽的最優工藝條件為：底物濃度59.0 g/L，發酵時間 56.5 h，接種量 3.22∶100（體積比）此時多肽含量為2.31 mg/mL，·OH清除率為78.94%；酶解時間 3.0 h、pH 9.5、酶解溫度 60 ℃、酶底比 390 U/g[2]，此條件下制備得到酶解液多肽含量5.48 mg/mL，多肽含量較單一發酵提高2.39倍，·OH清除率為93.62%。

采用超濾法分離得到分子量為0～1 kDa、1 kDa～5 kDa和0～5 kDa的豬血抗氧化低聚肽，采用·OH清除率、·O2-清除能力，抑制脂質過氧化能力、還原力、ABTS＋·清除率、DPPH·清除率、總抗氧化力7種體外抗氧化指標比較3種不同分子量段的豬血低聚肽的抗氧化活性，結果表明：3種不同分子量段抗氧化肽活性大小為 0～1 kDa＞ 0～5 kDa＞ 1 kDa～5 kDa，說明高活性的豬血抗氧化肽分子量集中在1 kDa以下。