藻藍蛋白和松花粉的復合物對腸道微生物的影響

謝園園，秦松，石麗花，朱立猛，王桐，尹利端，李文軍，*

（1.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺264003；2.煙臺新時代健康產業有限公司，山東煙臺264006）

藻藍蛋白（phycocyanin，PC）是一種存在于紅藻和藍藻細胞內的光合輔助色素，能高效捕獲光能[1]。它既是一種蛋白質，又是一種極好的天然食用色素，同時又是良好的保健食品，亦可用于制藥行業，具有抗腫瘤，抗炎，抗氧化等多種生物學功能，同時能夠提高淋巴細胞活性，增強人體免疫力[2]。松花粉是我國傳統的食藥用佳品，含有近百種酶和多種活性氨基酸，且配比合理，有“微型營養庫”之稱[3]。服用松花粉，可以促進胃腸蠕動，增進食欲，幫助消化，對胃腸功能紊亂癥有明顯調節作用[4]。

人體消化道由動態和高度復雜的微生物群落組成。這些微生物主要由細菌組成，總數超過1014個細胞和數千個個體菌株[5]。腸道中的厭氧微生物種類超過1 000種，數量是人體細胞的10倍，其所包含的基因約是人體基因的100多倍，腸道已被認為是人體的一個重要的“微生物器官”[6-8]。腸道菌群在營養代謝，病原體抗性和免疫系統發育中起著至關重要的作用，腸道菌群失調會導致宿主疾病的發生[9]。研究表明高濃度蛋白質能促進腸道細菌的生長，相反，腸道中細菌可利用未消化的蛋白質，然后將這些膳食營養物質進行微生物發酵，產生代謝產物如短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA），SCFAs作為結腸上皮細胞的燃料并誘導腸細胞增殖，對人體健康有益[10]。

正常情況下，人體腸道菌群的組成和結構相對穩定，然而，這種平衡在一定條件下會被打破，導致宿主疾病[11]。影響腸道菌群多樣性的因素有很多，飲食、抗生素的使用基因型等均會對腸道菌群的多樣性產生一定的影響[12]，而飲食是影響腸道菌群多樣性的主要原因。藻藍蛋白和松花粉均是常見的營養保健品，其中含有的蛋白和多糖等營養成分對腸道健康具有廣泛的作用。因此，本文應用藻藍蛋白和松花粉的復配產物，以C57BL/6小鼠為研究對象，探究藻藍蛋白和松花粉的復配產物對腸道菌群的調節作用，為藻藍蛋白和松花粉的應用提供更多基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

QIAamp DNA stool mini kit、凝膠提取試劑盒：Qiagen公司，德國；TruSeq DNA無PCR反應制備試劑盒：Illumina 公司，USA；PrimeScriptTMRT regent Kit、熒光定量PCR引物 SYBR Premix Ex Taq：TaKaRa。

藻藍蛋白：福清市新大澤螺旋藻有限公司；破壁松花粉：煙臺新時代健康產業有限公司。

ABI GeneAmp@9700 PCR系統：北京賽百奧科技有限公司；Qubit 2.0熒光計：Thermo Scientific公司。

1.2 實驗動物及樣本采集

6～8周齡，無特定病原體的雄性C57BL/6小鼠18只，均由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，體重（20±2）g，所有動物均飼養于綠葉制藥有限公司動物房，控制恒溫（23±2）℃，恒濕（50%～60%），12 h/12 h的光照/黑暗循環，飼養期間自由攝食、攝水，實驗開始前，所有動物均在此環境下適應性飼養一周。

小鼠適應性飼養一周后，隨機分為2組（每組9只）：對照組（蒸餾水）、1.5 g/kg松花粉+50 mg/kg藻藍蛋白組，通過灌胃的方式干預4周，對照組用相同體積的蒸餾水進行灌胃。

在實驗開始前一天及實驗結束時收集糞便樣品，取樣時，將小鼠單獨放置在經過滅菌的籠子里，每只小鼠收集100 mg～150 mg新鮮的糞便于凍存管中，收集完將樣品立即保存在-80℃冰箱中，用于檢測16S rRNA V3和V4高變區腸道菌群的變化，并于實驗結束后，腹腔注射200 mg/kg的戊巴比妥鈉，將小鼠進行安樂死。

1.3 基因組DNA的提取

根據QIAamp DNA stool mini kit的說明書提取糞便樣品的總基因組DNA。在1%瓊脂糖凝膠上監測DNA濃度和純度。根據濃度，用無菌水稀釋DNA至1 ng/μL。

1.4 16S rRNA V3和V4區PCR擴增

選擇16S rRNA的V3和V4高變區進行擴增，使用帶 Barcode 的特異性引物：338F，5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’進行擴增。所有PCR反應均使用高保真PCR主混合物（New England Biolabs）進行。

1.5 PCR產物定量和鑒定

將等體積的1倍上樣緩沖液與PCR產物混合，并在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。在400 bp～450 bp之間選擇帶有明亮主帶的樣品用于進一步的實驗。

1.6 PCR產物混合和純化

PCR產物以等密度比混合。然后，用Qiagen凝膠提取試劑盒純化混合物PCR產物。

1.7 文庫準備和測序

按照制造商的建議和索引代碼，使用TruSeq DNA無PCR反應制備試劑盒產生測序文庫。在Qubit 2.0熒光計和Agilent Bioanalyzer 2100系統上評估文庫質量。最后，在IlluminaHiSeq2500平臺上對文庫進行測序，并產生250 bp的配對末端讀數。

1.8 數據分析

為了使信息分析結果更準確可靠，首先對原始數據進行拼接，過濾，得到有效的數據。雙鏈測序的片段經FLASH拼接，OTU聚類和物種分類以97%的相似度閾值進行分析。根據OTU聚類的結果，一方面用RDP分類器對每個OTU的代表序列進行注釋，得到相應的物種信息和物種豐度分布。同時利用QIIME軟件對序列進行分析，利用Perl語言和R語言軟件對α和β的多樣性進行分析，得到樣本中物種豐富度和均勻度的信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等。另一方面，基于UniFrac距離，采用主坐標分析對樣本進行加權，并對樣本進行聚類，以獲得不同樣本和群體的群落結構差異。

通過單因素方差分析（Tukey檢驗）來判斷不同組之間的差異。上述統計分析采用SPSS19.0軟件進行，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 α多樣性分析

為了探究樣本量是否充足及藻藍蛋白松花粉復合物干預后腸道菌群豐富度和多樣性的變化，進行了α多樣性分析，如圖1。

圖1 α多樣性分析Fig.1 Alpha-diversity analysis

基于Illumina Miseq平臺的的16S rRNA的V3和V4高變區測序結果顯示，通過過濾量控制和嵌合體去除后，獲得了3 052 642個有效序列，有效序列的平均長度372。稀釋性曲線是采用對測序序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數與它們所能代表OTU的數目構建曲線，當曲線趨于平坦時，說明測序數據量合理，更多的數據量對發現新OTU的邊際貢獻很小；反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OUT。測序結果表明，樣品的稀釋曲線（圖1A）已進入平臺期，達到飽和狀態。說明在本實驗的測序量下，測序數據量足夠大，可以反映樣品中絕大多數的微生物物種信息。ACE是用來估計群落中含有OTU數目的指數，ACE值越大，說明群落物種越豐富，Shannon是用來估算樣品中微生物的多樣性指數，Shannon值越大，說明群落多樣性越高。測序結果表明，藻藍蛋白和松花粉復配組樣品的ACE值（圖1B）和Shannon值（圖1C）均大于對照組，表明藻藍蛋白和松花粉的復配產物可以促進腸道菌群的豐富度和多樣性的增加。

2.2 門水平和科水平主要菌群的變化分析

為了分析腸道菌群的整體變化，對門水平相對豐度前七個的菌群和科水平相對豐度前十的菌群進行了比較，如圖2所示。

采用16S rRNA的V3和V4高變區的高通量測序分析C57BL/6小鼠腸道菌群的組成，結果發現，在門水平（圖 2A），Bacteroidetes，Firmicutes，Proteobacteria，Deferribacteres，Actinobacteria，Tenericutes和 Cyanobacteria是豐度最大的菌群，其中Bacteroidetes和Firmicutes是小鼠腸道里的兩大主導菌群，其相對豐度維持在90%左右，Parkar等[13]在研究中指出擬桿菌門和厚壁菌門是參與代謝未消化食物的主要細菌群。與對照組相比，SPC組Bacteroidetes的相對豐度增加，而Firmicutes的相對豐度降低，其他菌群未發生顯著變化。研究表明，擬桿菌門與厚壁菌門的比例與肥胖相關，肥胖患者中擬桿菌門與厚壁菌門的比值減小，在攝入藻藍蛋白和松花粉的復配產品之后，與對照組相比，擬桿菌門與厚壁菌門的比值增加，表明藻藍蛋白和松花粉的復配產品可能有助于減肥，然而小鼠的體重并未發生顯著變化，可能是干預時間太短，體重并未發生顯著變化[14-16]。在科水平（圖2B），藻藍蛋白和松花粉干預后，腸道菌群發生了顯著變化。Bacteroidales_S24-7_group，Lachnospiraceae，Lactobacilaceae，Erysipelotrichaceae，Helicobacteraceae，Prevotellaceae，Ruminococcaceae，Porphyromonadaceae，Bacteroidaceae和 Rikenellaceae是豐度最大的菌群，其中Bacteroidetes門中的Bacteroidales_S24-7_group和Firmicutes門中的Lachnospiraceae為主導菌群，其相對豐度大于60%。

圖2 藻藍蛋白和松花粉復配產物對小鼠腸道菌群組成的影響Fig.2 Effects of phycocyanin and pine pollen on the composition of intestinal microbiota

2.3 科水平單菌變化分析

為了探究藻藍蛋白和松花粉的復配物對對科水平小鼠腸道菌群組成的影響，對科水平的菌群進行了分析，如圖3所示。

圖3 藻藍蛋白和松花粉的復配產物對科水平小鼠腸道菌群組成的影響Fig.3 Effects of phycocyanin and pine pollen on the composition of intestinal microbiota at family

在科水平，藻藍蛋白和松花粉干預4周后，小鼠的腸道菌群發生了顯著變化。藻藍蛋白和松花粉干預后，Bacteroidales_S24-7_group，Lachnospiraceae 和 Ruminococcaceae的相對豐度顯著增加，而Clostridiaceae_1，Clostridiales_vadinBB60_group 和 Coriobacteri－aceae的相對豐度顯著下降。Bacteroidales-S24-7-group是Bacteroidetes門中含量最高的細菌，在藻藍蛋白和松花粉干預4周后相對豐度顯著增加。Firmicutes門中的Ruminococcaceae在藻藍蛋白和松花粉干預后，其相對豐度也顯著增加。Bacteroidales-S24-7-group和Ruminococcaceae屬于丁酸鹽產生菌，丁酸鹽在人體健康中起著重要作用，可直接為腸道上皮提供能量，改善腸道消化吸收營養，提高腸道免疫力[1-19]。藻藍蛋白和松花粉干預后Firmicutes中的Lachnospiraceae相對豐度顯著增加。有研究指出，Lachnospiraceae可用來預防人體結腸癌[20]。藻藍蛋白和松花粉干預后Firmicutes門中的Clostridiaceae_1和Clostridiales_vadinBB60_group的相對豐度顯著下降。Clostridiales_vadinBB60_group和Clostridiaceae_1都是梭狀芽孢桿菌，有些梭狀芽孢桿菌作為正常菌叢寄居在人或動物腸道內，部分梭菌對人或動物致病，它們大多產生強烈的外毒素，其中以破傷風梭菌和肉毒梭菌的毒力最強[21-22]。Actinobacteria門中的Coriobacteriaceae在藻藍蛋白和松花粉干預后，相對豐度顯著下降。Coriobacteriaceae是腸道中的正常菌群，有時也被認為是病態菌群，因為它們的出現與菌血癥，牙周炎和陰道病等一系列病理學有關[23]。

2.4 主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）干預前后腸道菌群的變化

為進一步探討藻藍蛋白和松花粉的攝入對腸道微生物組成的影響，建立了主坐標分析（PCoA）圖，見圖4。

圖4 藻藍蛋白和松花粉干預后的PCoA分析Fig.4 PCoA analysis after phycocyanin and pine pollen intervention

主坐標分析（PCoA）揭示了使用OTU在97%同一性閾值下的對照（CON）和藻藍蛋白松花粉復配（SPC）組的明顯聚類。主坐標分析圖顯示在藻藍蛋白和松花粉干預之前，PCoA圖顯示小鼠的腸道微生物組彼此高度相似，而在藻藍蛋白和松花粉干預4周后，腸道微生物組發生了明顯的分離。這一結果表明藻藍蛋白和松花粉可調節小鼠腸道微生物群的組成和多樣性。

3 結論

通過灌胃藻藍蛋白和松花粉的復配物，腸道菌群發生了顯著變化。干預后，與對照組相比，藻藍蛋白與松花粉復配組腸道菌群的豐富度和多樣性顯著增加。在門水平，Bacteroidetes的相對豐度增加，而Firmicutes的相對豐度降低。在科水平，藻藍蛋白和松花粉的復配促進了有益菌（Bacteroidales_S24-7_group，Lachnospiraceae和Ruminococcaceae）的定植，并降低條件致病菌（Clostridiaceae_1，Clostridiales_vadinBB60_group和Coriobacteriaceae）的相對豐度，這些都有益于提高人體免疫力，并降低與條件致病菌相關疾病發生的風險，大大促進人體健康。因此，藻藍蛋白和松花粉的復配產品，可以用以改善腸道菌群，提高免疫力，減少腸道相關疾病發生的風險，維持人體健康。