三七參芪膠囊安全性評價及緩解體力疲勞功能的研究

范治云，譚會萍，李志坤，陳峰，祝清芬

（1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250101；2.濟南市第三人民醫院，山東濟南250132）

三七（Panaxnotoginseng）為五加科人參屬植物，已有600年以上的藥用歷史，其根、莖、葉、花均可入藥。其含有皂苷、三七素、多糖、黃酮等多種成分，藥理作用主要體現在對血液系統、心血管系統、腦血管系統、神經系統、代謝、免疫調節系統等的影響[1-2]；西洋參（Panax quinquefolium L.）亦為五加科人參屬植物，其含有人參皂苷、多糖、氨基酸等多種有效成分，在抗腫瘤、心血管系統、調節免疫、代謝、抗氧化方面具多種藥理活性[3]；黃芪（Astragalus membranaceus）是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補氣固表、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌之功效，其主要活性成分黃芪甲苷具有調節免疫、缺血保護、心臟保護、抗炎、抗病毒和抗腫瘤等作用[4-5]。三七參芪膠囊是以三七、西洋參、黃芪為主要原料，經粉碎、混合等工藝而制成的保健食品，根據衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003年版）對三七參芪膠囊進行安全性評價及緩解體力疲勞的功能的初步研究[6]，為其在緩解體力疲勞功能方面保健產品開發提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 受試物

三七參芪膠囊（規格：0.45 g/粒；性狀：透明硬膠囊；內容物為淺黃色粉末）：由某生物制藥有限公司提供。保存條件：陰涼干燥處保存。保質期：24個月。

1.2 實驗動物與菌株

ICR小鼠（SPF級，生產許可證號：SCXK（魯）20140007）：濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。飼養環境：屏障級動物實驗室，使用許可證號：SYXK（魯）20130012。溫度：20℃～26℃，日溫差≤3℃，濕度：40%～70%，換氣次數：≥10次/h。照明時間：12 h明暗交替。

Ames試驗標準菌株 TA97、TA978、TA100 和TA102：購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。

1.3 儀器與試劑

BP 211D電子天平：德國Sartorius公司；GHP-9270型恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；XSC-小鼠恒溫游泳池：安徽正華儀器有限公司；電子秒表：深圳市惠波工貿有限公司；7180型全自動生化分析儀：日本日立公司；TDZ5-WS型離心機：長沙湘儀儀器有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度計：日本島津公司；SBA-70A乳酸儀：山東省科學院生物儀器公司；代謝活化系統（S9，批號3516）：上海寶錄生物科技有限公司；肝糖原試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.4 方法[6]

1.4.1 毒理學試驗

1.4.1.1 小鼠急性經口毒性試驗

選擇體重18 g～22 g小鼠20只，雌雄各10只。按最大耐受劑量法（test of maximum tolerated dose，MTD）進行，經口灌胃給予最大濃度為0.34 g/mL的受試物混懸液20 mL/kg bw，1日3次，劑量合計20 g/kg bw，觀察14 d，記錄中毒體征及死亡情況。

1.4.1.2 Ames試驗

TA97、TA98、TA100 和 TA102 4 種試驗菌株經鑒定符合鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型的各項特性，采用平板摻入法，共設5個劑量組，劑量分別為0.008、0.04、0.2、1.0、5.0 mg/皿，另設陰性對照與陽性對照組。分別在加或不加S9混合液條件下以平板摻入法進行試驗，每個菌株每個劑量均設3個平行皿，經37℃培養48 h后計數每皿回變菌落數，計算各組平均菌落數。

1.4.1.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

選擇體重25 g～30 g的小鼠50只，按體重隨機分為 5組，分別為 1.7、3.4、6.8 g/kg bw 3個劑量組，另設溶媒對照組及陽性對照組。陽性對照組經口灌胃給予環磷酰胺（40 mg/kg bw），溶媒對照組給予同等體積的0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液。采用30 h給藥法，常規取胸骨制片、固定、染色，計算微核細胞率，及嗜多染紅細胞與成熟紅細胞比值（PCE/NCE）。

1.4.1.4 小鼠精子畸形試驗

選擇體重25 g～35 g雄性小鼠25只，按體重隨機分為1.7、3.4、6.8 g/kg bw 3個劑量組，另設溶媒對照及陽性對照組，陽性對照組腹腔注射給予環磷酰胺（40 mg/kg bw），溶媒對照組給予同等體積的0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液。連續5 d，于首次給受試物后的第35天處死小鼠，取附睪制片，用高倍鏡對每只動物檢查1 000個精子。記錄畸變的類型和數量，計算精子畸形發生率。

1.4.2 緩解體力疲勞功能試驗

1.4.2.1 試驗分組及受試物給予方式

小鼠按體重隨機分為4個試驗大組，每大組小鼠40只，分為溶媒對照組、受試物低、中、高劑量組4個小組，每小組10只。4個試驗大組分別用于負重游泳實驗、血清尿素測定、血乳酸測定、肝糖原測定試驗。設三七參芪膠囊低、中、高劑量分別為0.45、0.9、2.7 g/kg bw，相當于人體推薦量的 5、10、30 倍劑量。臨用前用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液配制相應濃度的受試物溶液。各組小鼠灌胃體積為20 mL/kg，溶媒對照組給予同等體積的0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液，每天灌胃1次，連續30 d。

1.4.2.2 負重游泳實驗

末次給予受試物30 min后，將尾根部負荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深30 cm，水溫（25±1.0）℃，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間，即小鼠負重游泳時間。

1.4.2.3 血清尿素測定

末次給受試物30 min后，在溫度為30℃的水中不負重游泳90 min，休息60 min后，小鼠拔眼球采全血約0.5 mL（不加抗凝劑）。置4℃冰箱約3 h，血凝固后2 000 r/min離心15 min，取血清于生化分析儀上測定尿素含量。

1.4.2.4 肝糖原測定（蒽酮法）

末次給受試物后30 min頸椎脫臼處死動物，取肝臟經生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，準確稱取肝臟100mg左右，按糖原測試盒說明書操作。

1.4.2.5 血乳酸測定

末次給受試物30 min后，不負重在溫度為30℃的水中游泳10 min后停止，在游泳前眼內眥各采血20 μL：游泳后立即采血 20 μL；休息 20 min 后再各采血20 μL。用乳酸儀測定血乳酸，計算血乳酸曲線下面積。

血乳酸曲線下面積計算方法：

血乳酸曲線下面積=1/2×（游泳前血乳酸值+游泳后0 min的血乳酸值）×10+1/2×（游泳后0 min的血乳酸值+游泳后休息20 min的血乳酸值）×20

1.4.2.6 結果判定

負重游泳試驗結果陽性，且血乳酸、血清尿素、肝糖元3項生化指標中任意兩項指標陽性，即可判定該受試物具有緩解體力疲勞功能的作用。

1.5 統計學方法

2 結果與分析

2.1 毒理學試驗

2.1.1 急性經口毒性試驗

在14 d觀察期內，實驗動物未見中毒體征，生長良好，大體解剖未見異常。雌性、雄性小鼠經口MTD均大于20 g/kg bw，根據急性毒性分級標準，受試物屬無毒級。

2.1.2 Ames試驗

三七參芪膠囊Ames試驗結果見表1。

表1 三七參芪膠囊Ames試驗結果Table 1 The results of Ames test of SanQiShenQi capsule

由表 1 可知，采用 8、40、200、1 000、5 000 μg/皿 5個劑量，受試物各劑量組在加和不加S9條件下各菌株回變菌落數均未超過自發回變菌落數的2倍，各劑量組間亦無劑量反應關系，表明在加與不加S9條件下，受試物對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株菌株均未呈現遺傳毒性。

2.1.3 骨髓細胞微核試驗

三七參芪膠囊對小鼠骨髓細胞微核率的影響見表2。

由表2可知，各劑量組的微核率及PCE/NCE比值與陰性對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；陽性對照組微核率顯著高于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表2 三七參芪膠囊對小鼠骨髓細胞微核率的影響Table 2 Effect of SanQiShenQi capsule on the micronucleus rate of mice bone marrow

2.1.4 小鼠精子畸形試驗

三七參芪膠囊對小鼠精子畸形率的影響見表3。

表3 三七參芪膠囊對小鼠精子畸形率的影響Table 3 Effect of SanQiShenQi capsule on the malformation rate of mice sperm

由表3可知，各劑量組小鼠精子畸形率與陰性對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；陽性對照組的精子畸形率顯著高于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 緩解體力疲勞功能試驗

2.2.1 三七參芪膠囊對小鼠負重游泳時間的影響

三七參芪膠囊對小鼠負重游泳時間的影響見表4。

表4 三七參芪膠囊對小鼠負重游泳時間的影響Table 4 Effect of SanQiShenQi capsule on the weight loading swimming time of mice

由表4可知，低劑量組與溶媒對照組比較，負重游泳時間差異無顯著性（P＞0.05），中、高劑量組與溶媒對照組比較，負重游泳時間顯著延長（P＜0.05或P＜0.01）。提示三七參芪膠囊能明顯延長小鼠的負重游泳時間。

2.2.2 三七參芪膠囊對小鼠血清尿素含量的影響

三七參芪膠囊對小鼠血清尿素含量的影響見表5。

表5 三七參芪膠囊對小鼠血清尿素含量的影響Table 5 Effect of SanQiShenQi capsule on the content of serum urea nitrogen in mice

由表5可知，低、中劑量組與溶媒對照組比較，血清尿素含量差異無顯著性（P＞0.05），高劑量組與溶媒對照組比較，血清尿素含量顯著降低（P＜0.01）。提示三七參芪膠囊能明顯降低小鼠的血清尿素含量。

2.2.3 三七參芪膠囊對小鼠肝糖原含量的影響

三七參芪膠囊對小鼠肝糖原含量的影響見表6。

表6 三七參芪膠囊對小鼠肝糖原含量的影響Table 6 Effect of SanQiShenQi capsule on the content of liver glycogen in mice

由表6可知，低劑量組與溶媒對照組比較，肝糖原含量差異無顯著性（P＞0.05），中、高劑量組與溶媒對照組比較，肝糖原含量顯著增高（P＜0.01）。表明三七參芪膠囊能顯著提高小鼠的肝糖原水平。

2.2.4 三七參芪膠囊對小鼠血乳酸含量的影響

三七參芪膠囊對小鼠血乳酸含量的影響見表7。

表7 三七參芪膠囊對小鼠血乳酸含量的影響Table 7 Effect of SanQiShenQi capsule on the content of blood lactic acid in mice

由表7可知，低、中、高3個劑量組與溶媒對照組比較，血乳酸曲線下面積差異均無顯著性（P＞0.05）。提示三七參芪膠囊對小鼠血乳酸含量無顯著影響。

3 討論與結論

在急性經口毒性試驗中，未見小鼠出現中毒體征，雌雄小鼠經口MTD均大于20 g/kg bw，根據急性毒性分級標準，表明受試物屬無毒級；通過Ames試驗、微核試驗和精子畸形試驗3項遺傳毒性試驗，結果均為陰性，提示受試物未顯示有遺傳毒性，表明三七參芪膠囊是安全的。

負重游泳試驗是反應小鼠運動耐力的最直觀的指標，游泳時間的長短可以揭示動物運動疲勞的程度。尿素氮是蛋白質代謝的最終產物。長時間運動后，血清尿素氮含量降低表明蛋白質參與供能的比例相對減少，糖原、脂肪在運動中供能得到相應加強。因此，血清尿素氮的含量的降低在一定程度上表征了機體抗疲勞的能力[7]。糖原是機體高強度運動的主要能量來源，肝糖原是能量儲備的直接單位，運動導致大量糖原消耗，為維持血糖水平，肝糖原儲備量大量消耗。受試物如能增加肝糖原儲備量，則為機體提供更多的能量，達到抗疲勞的目的[7-8]。血乳酸是糖無氧酵解的最終產物，劇烈運動使體內乳酸堆積而引起運動性疲勞，因此，血乳酸水平可反應無氧代謝水平、疲勞的產生和消除速度[9-10]。

給予三七參芪膠囊30 d，中、高劑量組能明顯延長小鼠的負重游泳時間，高劑量組能明顯降低小鼠的血清尿素含量，中、高劑量組能顯著提高小鼠的肝糖原水平。但3個劑量組對小鼠血乳酸含量無顯著影響，對乳酸代謝方面的影響需要進一步研究。根據《保健食品檢驗與評價技術規范》2003年版判定標準，認為三七參芪膠囊具有緩解體力疲勞功能的作用，為其開發為緩解體力疲勞功能的保健產品提供了理論依據。