血漿Spetin9甲基化對結直腸癌的診斷和治療監(jiān)測作用

余南榮 黃志良 吳成杰 魯偉群 楊國華 徐厚巍 劉海鷹

廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胃腸腫瘤外科（廣州 510095）

結直腸癌（colorectal cancer）的發(fā)病率和死亡率近年在我國有持續(xù)升高的趨勢。早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療成為提高結直腸癌治愈率及延長患者生存時間的關鍵。但目前臨床中仍缺乏對結直腸癌早期診斷敏感且特異的腫瘤標志物，因此尋找更敏感和高特異性的監(jiān)測指標成為臨床亟待解決的問題。

Septin9基因甲基化是結直腸癌重要的生物學特征之一，其在結直腸癌患者外周血和腫瘤組織中均高表達，而在健康人群或其他結直腸疾病中呈低表達［1-2]。因此，Septin9基因甲基化有可能成為結直腸癌篩查診斷和治療監(jiān)測的一個候選標志物。但目前關于血漿甲基化Septin9在結直腸癌術后監(jiān)測、預測復發(fā)、評估生存等方面的報道較少，僅有小型病例研究結果表明Septin9甲基化可用于結直腸癌術后的隨訪監(jiān)測，并初步顯示其與結直腸癌患者術后生存呈負相關。此外，雖然血漿Septin9甲基化及血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）在結直腸癌診斷和監(jiān)測中都有重要作用，但每個指標單獨作為結直腸癌的診斷和預測指標都不能準確而完整地反映病情。因此，本研究擬通過采集結直腸癌患者手術前后及化療前后的外周血液，檢測血漿Septin9甲基化及血清CEA的表達并探索二者在結直腸癌診斷、預測復發(fā)方面的作用，從而為血漿Septin9甲基化成為結直腸癌診斷及監(jiān)測復發(fā)的標志物提供可靠的臨床依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象及病例入組標準于2015年12月至2016年4月間入組符合以下標準的結直腸癌患者：（1）既往未接受過任何抗腫瘤治療；（2）術后病理診斷證實為結直腸腺癌；（3）患者首次治療為手術切除或FOLFOX方案化療。同期收集30例我院自愿者健康人血液標本作為對照。病例剔除標準：（1）既往接受過抗腫瘤治療的患者；（2）術后病理診斷證實為非結直腸腺癌者；（3）患者首次治為非FOLFOX方案化療者。本研究已通過我院倫理委員會批準，所有研究對象已知情并簽署知情同意書。

1.2 血漿樣本的收集和保存對符合條件的結直腸腺癌病例依據(jù)治療方式進行分組：手術組血液標本的采集時間為：手術前、手術后4周；化療組血液采集時間為：化療前、2次化療后。每例血液樣本均詳細記錄對應患者的一般資料、臨床信息、病理資料等。采樣時抽取10 mL/支靜脈全血2支，分別以EDTA抗凝和真空無抗凝處理，用于提取血漿和血清。樣本可立即用于Septin9基因甲基化和CEA測定，或保存于-20℃低溫冰箱，4周內進行檢測。

1.3 血清CEA蛋白和血漿Septin9基因甲基化的檢測血清CEA表達水平由廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科采用放射免疫熒光進行檢測。采用Septin9基因甲基化檢測試劑盒（PCR熒光探針法）檢測血漿Septin9甲基化水平。按照試劑盒說明書步驟對血漿中DNA進行提取、磁珠結合、洗滌和亞硫酸鹽轉化處理，然后每個DNA樣本中按比例加入相應體積的PCR反應液和PCR聚合酶（PCR Master Mix），按照常規(guī)PCR擴增進行40個熱循環(huán)后讀取數(shù)據(jù)結果。每次實驗均設陰性和陽性對照，所有樣本均進行3次重復試驗。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有假設檢驗比較均為雙側，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。計量資料兩組組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料組間比較采用行×列χ2檢驗。

2 結果

2.1 結直腸癌患者血漿Septin9甲基化和血清CEA的表達情況在2015年12月至2016年4月間共收集符合條件的結直腸癌血漿樣本35例和健康人群血漿樣本30例。35例患者中，治療前血漿Septin9甲基化陽性表達26例，陰性表達9例，陽性率為74.3%（26/35）；血清CEA高于正常對照值（5.0 ng/mL）的有21例，正常范圍內的有14例，陽性率為60.0%（21/35）。健康人群中血漿Septin9甲基化陽性0例，陰性30例，陽性率為0.0%（0/30）；血清CEA高于正常對照值（5.0 ng/mL）的有3例，正常范圍內的有27例，陽性率為10.0%（3/30）。Septin9甲基化和血清CEA在結直腸癌患者和健康人群中的表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001）。見表1。

表1 結直腸癌患者及健康人血漿Septin9甲基化和血清CEA的表達情況Tab.1 Comparison of plasma Septin9 methylation andserum CEA in colorectal cancerpatients and health controls

2.2 治療前后結直腸癌患者血漿Septin9甲基化的表達35例結直腸癌患者中有26例直接接受手術治療，另外9例接受FOLFOX方案化療。手術組中有20例術前為Septin9甲基化陽性，6例為陰性；經(jīng)手術完全切除腫瘤后由陽性變?yōu)殛幮?5例（轉陰率為75.0%），持續(xù)陽性5例，持續(xù)陰性的6例；術前血清CEA陽性（＞5.0 ng/mL）的有15例，陰性（＜5.0 ng/mL）有11例，術后由陽性變?yōu)殛幮?1例（轉陰率為73.3%），持續(xù)陽性4例，持續(xù)陰性的11例。

在化療組中，化療前血漿Septin9甲基化陽性有6例，陰性3例，經(jīng)化療后由陽性變?yōu)殛幮?例（轉陰率16.7%），持續(xù)陽性5例，持續(xù)陰性3例；化療前血清CEA陽性（＞5.0 ng/mL）的有6例，陰性（＜5.0 ng/mL）有3例，化療后由陽性變?yōu)殛幮?例（轉陰率為16.7%），持續(xù)陽性5例，持續(xù)陰性有3例。分析結果顯示，無論對于血漿Septin9甲基化或血清CEA水平，手術治療后指標轉陰率較化學治療更高（P=0.010，P=0.018）。見表2。

表2 手術治療和化學治療前后血漿Septin9甲基化血清CEA水平的變化Tab.2 Changes of plasma Septin9 methylation，serumCEA before and after operation and chemotherapy

2.3 血漿Septin9甲基化與臨床病理特征的相關性通過記錄每例樣本的性別、年齡、腫瘤位置及TNM分期等臨床資料，與血漿Septin9甲基化檢測結果進行相關性分析（因35例結直腸癌患者中有2例無法確定病理分期，因此TNM分期與血漿Septin9甲基化相關性分析只納入33例患者）。結直腸癌患者血漿Septin9甲基化與臨床各病理參數(shù)的相關性如表3所示，Septin9甲基化水平與結直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期和是否存在遠處轉移均無明顯相關性（P＞0.05）。

2.4 血漿Septin9甲基化和血清CEA聯(lián)合檢測對結直腸癌診斷的意義上述部分結果表明血漿Septin9甲基化與臨床結直腸癌診斷的相符率為74.3%，血清CEA對結直腸癌診斷陽性率為60.0%，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.203），提示兩者診斷效能相類似。為進一步分析兩種分子標志物對提高結直腸癌診斷的準確性，筆者分析了血漿Septin9甲基化聯(lián)合血清CEA水平對結直腸癌的診斷率，結果顯示兩者聯(lián)合診斷結直腸癌的陽性率為82.9%，較單獨檢測血清CEA水平的陽性率明顯升高（P=0.034）。見表4。

表3 35例結直腸癌患者血漿Septin9甲基化與臨床病理參數(shù)的相關性Tab.3 Relationship between plasma Septin9 methylation and clinicopathological parametersin 35 colorectal cancer patients

表4 血漿Septin9甲基化和血清CEA水平檢測對結直腸癌診斷比較Tab.4 Comparison of the diagnostic value between plasma Septin9 methylation and serum CEA

3 討論

Septin基因廣泛存在于絕大多數(shù)真核生物中，人類基因組中已發(fā)現(xiàn)14個Septin基因，分別被命名為Septin1～Septin14。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Septin家族與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、感染、不育癥等疾病發(fā)生有關。Septin基因家族相關的腫瘤疾病包括白血病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎細胞癌等實體腫瘤。Septin9定位于染色體17q25.3，該染色體區(qū)段是散發(fā)性卵巢癌和乳腺癌的常見雜合性丟失部位。研究表明，結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與基因的甲基化密切相關［3]，基因芯片檢測結果分析表明Septin9在乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、子宮內膜、腎臟、肝、肺、淋巴、食管、卵巢、胰腺、軟組織、皮膚、甲狀腺等來源的腫瘤中高表達。

目前有研究表明血漿Septin9甲基化在結直腸癌診斷中具有一定的意義［4-12]。學者發(fā)現(xiàn)直結腸癌患者患病的過程中體內的部分基因發(fā)生甲基化，將甲基化的異常基因作為分子標記物對于疾病的篩查具有一定的可操作性［13-14]。GRüTZMANN等［15]進行了結直腸癌患者血漿甲基化Septin9檢測研究，其結果顯示血漿甲基化Septin9在結直腸癌患者中的陽性率為48%（120/252），明顯高于健康對照組的7%（7/102）。康倩等［16]研究表明，結直腸癌患者血漿中Septin9基因甲基化檢測的靈敏度為75.0%，特異度為98.1%，優(yōu)于糞便隱血試驗。有研究發(fā)現(xiàn)，Septin9基因甲基化檢測結直腸癌不受年齡和性別的影響，但其基因甲基化水平與種族有一定的相關性［17-18]。本研究通過分析結直腸癌患者治療前后血漿Septin9甲基化狀態(tài)與血清CEA蛋白水平，發(fā)現(xiàn)血漿Septin9甲基化對結直腸癌的診斷陽性率與血清CEA水平相似，兩者聯(lián)合檢測可顯著提高診斷陽性率；治療后血漿Septin9甲基化狀態(tài)也可出現(xiàn)相應變化，提示其也可用于治療期間的病情監(jiān)測。

在本研究中，結直腸癌患者中Septin9的甲基化水平顯著高于健康人群，其陽性率達到74.3%，再加上血漿Septin9甲基化水平檢測具有無創(chuàng)、簡便、靈敏度較高的優(yōu)勢，故筆者認為其是輔助結直腸癌診斷較為理想的指標。在本研究中，筆者還發(fā)現(xiàn)手術組結直腸癌患者中，手術切除腫瘤后血漿Septin9甲基化由陽性變化為陰性的比例顯著高于化療組，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.010），提示Septin9的甲基化水平與結直腸癌患者的帶瘤狀態(tài)顯著相關，并具有類似于血清CEA可監(jiān)測結直腸癌患者治療后復發(fā)轉移的潛能，但其預測作用及其特異性仍需進一步研究。

由于本研究的結果提示血漿Septin9甲基化與血清CEA均有輔助結直腸癌診斷的作用，但單獨檢測血漿Septin9甲基化或血清CEA仍容易漏診一部分結直腸癌患者；且在健康人群中，血清CEA也存在一定的假陽性率，目前關于血漿Septin9甲基化和血清CEA聯(lián)合檢測的報道較少，需進一步對該方向進行深入研究。為此，本研究分析了血漿Septin9甲基化與血清CEA水平聯(lián)合檢測對結直腸癌的診斷陽性率，其結果為82.9%，與CEA單獨檢測比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.034），提示血漿Septin9甲基化與血清CEA的聯(lián)合檢測可以提高結直腸癌檢測的陽性率。同時Septin9的甲基化水平檢測可提示結直腸癌患者的荷瘤狀態(tài)。因此，檢測Septin9的甲基化水平，特別是與CEA聯(lián)合進行檢測，具有重要的臨床應用價值。

綜上所述，血漿Septin9甲基化水平的檢測具有可作為結直腸腺癌的篩查和診斷指標的潛能，其對結直腸癌的診斷效能與血清CEA相類似，陽性符合率高達74.3%，且本研究中Septin9甲基化水平診斷結直腸癌的敏感性稍優(yōu)于血清CEA水平的檢測。若將血漿Septin9甲基化水平檢測及血清CEA水平檢測二者聯(lián)合應用，其敏感性優(yōu)于血清CEA單獨檢測，兩者聯(lián)用可以提高結直腸腺癌診斷的陽性率，具有一定的臨床應用價值。