HPLC測定櫻桃咯菌腈的殘留量研究

張雪丹，楊娟俠，辛 力，王明林，連玉晶，劉 濤

（1.山東省果樹研究所，山東泰安 271000；2.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安 271000；3.山東黃島出入境檢驗檢疫局，山東青島 266000）

咯菌腈（Fludioxonil），化學名稱4-（2,2-二氟-1,3-苯并間二氧-4-基吡咯-3-腈），商品名為Saphire，Celest或適樂時[1]。該產品是1984年由瑞士Ciba-Geigy公司（現先正達公司）開發的苯基吡咯類殺菌劑，對防治根腐病、青枯病、莖基腐病等疾病具有顯著效果，可廣泛應用于棉花、小麥、花生、大豆、水稻等多種作物種子的處理上[2-4]。咯菌腈作為一種新型的低毒低殘留仿生殺菌劑，對果蔬采后貯藏保鮮過程中產生的綠霉、青霉、干腐病、灰霉菌等也有很好的防治效果，已有其在柑橘、蘋果、馬鈴薯、草莓、葡萄、石榴等果蔬應用的品質保持和安全性檢測等研究報道[5-10]。

分子結構見圖1。

圖1 分子結構

最大殘留限量Maximum residue limits（MRL） 是某一種化學殘留物在特定食品中合法的或可被接受的最高含量，單位是mg/kg，是食品安全檢驗的重要指標。美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭、歐盟等均允許將咯菌腈用于果蔬采后殺菌保鮮處理，但各方對最大殘留限量MRL的規定不一。其中，美國、澳大利亞和新西蘭規定核果類（桃、櫻桃、杏等）MRL為5.0 mg/kg；加拿大規定菠蘿MRL為20 mg/kg，柑橘類果實為10 mg/kg，西紅柿為5 mg/kg；歐盟規定葉菜類MRL為20 mg/kg。目前，我國尚未準許咯菌腈用于果蔬采后殺菌保鮮，山東營養源食品科技有限公司已向農業部提交此方面的申請。

山東省果樹研究所果品貯藏保鮮課題組自2016年以來一直開展咯菌腈對櫻桃貯藏保鮮品質及安全性研究。研究發現，櫻桃經咯菌腈處理后不僅可以大大降低果實貯藏期腐爛率，還在保持果實硬度和果梗色澤和降低果實凹陷率等方面具有良好的效果。但咯菌腈處理后的果實食用安全性是其應用的前提，咯菌腈殘留量是評價其安全性能最重要的指標之一。因此，利用高效液相色譜法（HPLC） 測定不同處理的櫻桃咯菌腈的殘留量，為咯菌腈在果蔬貯藏保鮮應用方面提供理論依據。

1 試驗條件與方法

1.1 試驗原料

櫻桃，品種為“紅燈”，2016年5月和2017年5月采于山東省泰安市新泰區宮里櫻桃園，八九成熟，去除病蟲害、畸形果等。果實為現采果，運回實驗室立即進行咯菌腈浸泡處理。

LC-20A型液相色譜儀，日本島津公司產品。

乙腈（色譜級）、咯菌腈標準品（含量99.5%）、氯化鈉（NaCl）和無水硫酸鎂（MgSO4），均為分析純；實驗用咯菌腈（含量50.0%），由美國先正達公司生產提供。

1.2 色譜操作條件

色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈∶水（75∶25，V∶V），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長240 nm，進樣體積20.0 μL。可根據不同的儀器適當調整操作參數，以獲得最佳分析效果。

1.3 咯菌腈處理櫻桃方法

1.3.1 果面水分對櫻桃果實咯菌腈殘留量的影響

取100個櫻桃果，分別用含量為200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s，然后裝盒，或者用衛生紙將果面水分擦干后裝盒，再用HPLC測咯菌腈殘留量，每個處理做3個重復。

1.3.2 不同浸泡時間咯菌腈處理櫻桃果實的殘留量

取100個櫻桃果，分別用含量為200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡不同時間（10，20，30，40，50，60 s）后裝盒，用HPLC測咯菌腈殘留量，每個處理做3個重復。

1.3.3 不同含量咯菌腈處理櫻桃果實的殘留量

取100個櫻桃果，分別用不同含量（100，200，300 mg/kg） 的咯菌腈溶液浸泡20 s，然后吸干果面水分后裝盒，用HPLC測咯菌腈殘留量，每個處理做3個重復。

當腔長L為λ/8的奇數倍，即L=(2m+1)λ/8時干涉光強達到最大值；當腔長L為λ/8的偶數倍時，也即L=2mλ/8時干涉光強最小.這兩種情況下的輸出信號都是非線性的，系統的靈敏度最低.而在信號曲線斜率最大的位置，光強信號的線性最好，此時系統的靈敏度也最高.因此在采用F-P干涉檢測微懸臂的偏移時，將參考點設置在信號線性斜率最大的位置，即圖4中所示的Q點.將該點對應的F-P干涉儀腔長定義為參考點腔長，F-P干涉儀工作之前的腔長定義為初始腔長，微懸臂偏移時的腔長定義為工作腔長.

1.3.4 水沖洗對櫻桃果實咯菌腈殘留量的影響

取100個櫻桃果，用含量為200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s，然后用水沖洗5 min再吸干果面水分后裝盒，測咯菌腈殘留量，每個處理做3個重復。

2 試驗步驟

2.1 標樣溶液的配制

稱取標樣1.00 g（精確至0.000 1 g），置于100 mL容量瓶，加入乙腈超聲波處理10 min，然后定容為100 mg/L的標樣溶液。用0.45 μm濾膜過濾至玻璃LC小瓶中，進行HPLC分析。

標樣溶液液相色譜見圖2。

圖2 標樣溶液液相色譜

2.2 櫻桃樣品HPLC測定預處理

處理后的樣品果去核，然后低溫破碎，快速稱取樣品10.00 g于50 mL玻璃具塞離心管，加入10.00 mL乙腈，超聲提取15 min，再加入1.00 g氯化鈉和4.00 g無水硫酸鎂（MgSO4），渦旋1 min，隨后以轉速4 000 r/min離心5.0 min；取1.00 mL上清液，同時加入100.00 mg MgSO4和10.00 mg石墨碳（GCB），渦旋30 s；上清液過0.45 μm濾膜至玻璃LC小瓶中，濾液進行HPLC分析。

2.3 樣品測定

根據上述方式處理樣品，待高效液相色譜儀平穩后按順序進樣檢測。

2.4 計算與統計分析

咯菌腈標準溶液濃度為C標，HPLC所測得的咯菌腈標準溶液的峰面積為A標，HPLC所測得的試樣溶液的咯菌腈峰面積為A樣，則試樣中咯菌腈的質量濃度C樣（mg/L） 按下式計算：

式中：V樣——標樣溶液的體積，L；

m樣——櫻桃試樣的質量，kg。

每個樣品做3次重復，咯菌腈的殘留量X均為3次重復試驗結果平均值，以X±RSD（%）表示。

3 結果與分析

3.1 果面水分對櫻桃果實咯菌腈殘留量的影響

櫻桃果實采后最好經低溫水預冷處理以降低果實溫度、減少果面附著的灰塵與病菌等，預冷水處理后的果面和果梗處有細微的殘存水珠，生產上若是直接銷售時是不對殘存水珠做吸干處理的。試驗櫻桃經低溫咯菌腈溶液浸泡處理后直接裝盒測定，或者對果面水分進行吸干處理，以此來判斷果面殘存液對櫻桃果實咯菌腈殘留量的影響。測定發現，櫻桃經低溫咯菌腈溶液浸泡處理后直接裝盒的果實咯菌腈殘留量為1.997 mg/kg±6.94%，而經咯菌腈溶液浸泡處理后對果面水分進行吸干處理的果實咯菌腈殘留量為0.161 mg/kg±0.22%，即經咯菌腈溶液浸泡后殘存的果面水分對櫻桃果實咯菌腈殘留量影響很大，建議用咯菌腈溶液處理櫻桃果實后進行水分吸干處理以降低咯菌腈殘留量。但無論是否進行水分吸干處理，200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s后櫻桃果實咯菌腈殘留量均低于5.00 mg/kg。

3.2 浸泡時間對櫻桃果實咯菌腈殘留量的影響

課題組研究發現，用100 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s處理櫻桃果實就可以減少果實掉柄率、保持果實色澤、降低果實腐爛率和延長果實保鮮期。研究發現，增加咯菌腈溶液含量（100～600 mg/kg） 不會對櫻桃果實產生傷害。試驗用含量為200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡櫻桃果實不同時間（10，20，30，40，50，60 s），以此研究浸泡時間對櫻桃果實咯菌腈殘留量的影響。

不同浸泡時間的櫻桃果實咯菌腈殘留量見表1。

表1 不同浸泡時間的櫻桃果實咯菌腈殘留量

由表1可知，隨著咯菌腈溶液浸泡時間的延長，櫻桃果實咯菌腈的殘留量逐漸升高。在不擦干果面殘留液的情況下，200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡60 s處理櫻桃果實的咯菌腈的殘留量為4.276 mg/kg±0.22%，低于5.00 mg/kg。因此，建議在保證咯菌腈殺菌及保持果實品質效果的情況下，櫻桃果實在咯菌腈溶液中的浸泡時間越短越好。

3.3 不同含量咯菌腈處理櫻桃果實的殘留量

通過檢測100，200，300 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s后果實的咯菌腈殘留量，用以確定咯菌腈溶液含量對櫻桃咯菌腈殘留量的影響。研究發現，100 mg/kg咯菌腈溶液浸泡20 s后果實的咯菌腈殘留量為0.161 9±4.72%，200 mg/kg咯菌腈溶液處理的咯菌腈殘留量為0.161 mg/kg±0.22%，300 mg/kg咯菌腈溶液處理的咯菌腈殘留量為0.169 mg/kg±8.84%。由此可知，進行水分吸干處理的前提下，不同含量的咯菌腈溶液（100～300 mg/kg） 浸泡處理櫻桃20 s后果實的咯菌腈殘留量幾乎相同，即咯菌腈含量對短時浸泡櫻桃果實的咯菌腈殘留量的影響較少。

3.4 水沖洗對櫻桃果實咯菌腈殘留量的影響

咯菌腈溶液短時浸泡即可殺滅附著在櫻桃果面的病菌，為了盡可能少地降低果實咯菌腈殘留量，測定了櫻桃經咯菌腈溶液浸泡后在自來水中沖洗5 min后的咯菌腈殘留量，研究水沖洗對咯菌腈殘留量的影響。結果表明，櫻桃果實經含量為200 mg/kg的咯菌腈溶液浸泡20 s后用水沖洗5 min再吸干果面水分后的咯菌腈殘留量為0.003 1 mg/kg±16.64%，而未經水沖洗的櫻桃咯菌腈殘留量為0.161 mg/kg±0.22%，即櫻桃經咯菌腈溶液浸泡后再用水沖洗可大大降低櫻桃果實咯菌腈的殘留量。結合生產實際，建議櫻桃果實采后預冷分級時先用咯菌腈溶液短時浸泡處理降低櫻桃果面的病菌和灰塵，再用預冷水沖洗櫻桃以降低果溫和果實表面殘存的咯菌腈。

4 結論

試驗建立了利用HPLC檢測櫻桃咯菌腈的殘留量分析方法，研究了咯菌腈溶液浸泡櫻桃時果面水分、浸泡時間、溶液濃度及浸泡后水沖洗處理對櫻桃果實咯菌腈殘留量的影響。結果表明，咯菌腈溶液處理櫻桃果實后吸干果面水分處理可大大降低咯菌腈殘留量；隨著咯菌腈溶液浸泡時間的延長，咯菌腈殘留量逐漸升高，但咯菌腈濃度對短時浸泡櫻桃的咯菌腈殘留量影響較少。同時，咯菌腈溶液處理后再用水沖洗櫻桃也可降低果實咯菌腈的殘留量。所有檢測結果表明，櫻桃經咯菌腈處理后的殘存量很低，均未超過國外果蔬關于咯菌腈最大殘留量的標準，可以安全食用。