野西瓜提取物對小鼠酒精性肝損傷的保護作用

宋曙輝 ，時 月 ，2，3，王宇濱 ，李 武 ，4，馬 越 ，3，趙曉燕 ，4， 張 超 ，2，3

（1.北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京 100097；2.果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室，北京 100097；

3.農業部蔬菜產后處理重點實驗室，北京 100097；4.農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京 100097）

野西瓜（Citrullus colocynthis L.），為葫蘆科西瓜屬植物，原產于北非、中亞和西亞，在我國西北有少量分布[1]。野西瓜是維吾爾醫傳統藥材，是伊斯蘭各國臨床藥材。維吾爾醫理論認為野西瓜具有祛風、消腫、祛痰質、生津液等功效[2]，主要用于治療肝病、血液病和糖尿病[3-4]。現代科學動物試驗研究證明野西瓜藤提取物對糖尿病小鼠具有降血糖作用[5]；野西瓜果實提取物具有降低糖尿病小鼠、大鼠和兔子血糖水平的作用[6-8]，但是采用現代科學試驗研究野西瓜果實對肝損傷保護作用的研究鮮有報道。

試驗以乙醇誘導的酒精性肝損傷小鼠為研究對象，通過灌胃給予野西瓜提取物28 d，考查小鼠肝臟組織中關鍵代謝指標和病理組織形態，評價野西瓜提取物對小鼠由酒精性肝損傷的保護作用，并通過化學檢測方法對功能性組分進行探索，以期為野西瓜資源的開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與化學試劑

野西瓜，采自北京蔬菜研究中心四季青農場；SPF級雄性昆明種小鼠，體重18.3～22.4 g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證編號SCXK（軍） 2012-004；葫蘆素A（純度98%）、葫蘆素B（純度99%） 和葫蘆素E（純度95%），由上海同田生物技術股份有限公司提供；乙腈為色譜純，由迪馬科技有限公司提供；化學試劑均為分析純，中國化學試劑有限公司提供；還原性谷胱甘肽檢測試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 試驗設備

1.3 野西瓜提取物的制備

將成熟野西瓜采收，置于10℃的冷庫中預冷24 h，使用自來水清洗果實表面，使用食品料理機將果實機械破碎2 min，采用雙層紗布過濾去除瓜籽等雜質獲得野西瓜汁，加入野西瓜汁4倍體積的丙酮溶液，機械攪拌90 min，采用分液漏斗收集丙酮提取物，旋轉蒸發至原體積的10%，冷凍干燥獲得野西瓜提取物。

1.4 葫蘆素A含量的測定方法

建立HPLC的方法測定葫蘆素A含量的方法。準確稱量葫蘆素A標準品5～10 mg置于10 mL容量瓶中，用色譜級乙醇定容至10 mL，配制成標準品母液，再將此標準品母液分別稀釋成5個不同質量濃度，采用Agilent HPLC 1260系列色譜儀進行分離，色譜柱選擇Agilent XBridge-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），采用DAD檢測器，監測波長228 nm光譜信息，控制柱溫25℃，進樣量20 μL，色譜柱流速1 mL/min，流動相A為純水，流動相B為乙腈，采用流動相A和流動相B各50%，洗脫25 min。以葫蘆素標準品的質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

葫蘆素A標準品液相色譜圖及其標準曲線見圖1。

圖1顯示葫蘆素A標準品在波長228 nm處的色譜圖，葫蘆素A的保留時間為2.316 min，其回歸方程為Y=51 856X+230.8，相關系數R2=0.996 5。

采用外標法測定樣品中葫蘆素A含量，將野西瓜提取液使用0.22 μm微孔濾膜過濾，使用與標準品相同的液相條件進行分析，計算樣品中葫蘆素A的含量。

1.5 試驗設計及處理

圖1 葫蘆素A標準品液相色譜圖及其標準曲線

將小鼠進行適應性飼養3 d后，隨機分為對照組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，共5組，每組12只小鼠。低劑量組、中劑量組和高劑量組每天給藥劑量為0.7，2.0，3.5 mg/kg體重的野西瓜提取物，野西瓜提取物使用純水溶解，灌胃劑量為5 μL/g體重。對照組和模型組給予同等體積蒸餾水灌胃，連續4周。在試驗第29天將模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組按12 mL/kg經口腔灌胃體積分數為50%的乙醇，對照組以等量蒸餾水灌胃。隔夜禁食16 h后處死，取肝臟，測定肝臟組織中還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA） 和甘油三酯（TG） 含量，并取肝臟做病理切片，采用HE染色，觀察肝臟的病理損傷情況[9]。

1.6 GSH、MDA和TG的測定方法

將肝臟用生理鹽水制成10%的肝勻漿，檢測肝組織中GSH、MDA和TG的含量。肝組織中MDA采用硫代巴比妥酸法測定、GSH采用南京建成生物工程研究所的試劑盒方法測定；TG含量采用505nm比色法測定。

1.7 肝臟病理組織學觀察及評分標準

（1）肝臟病理切片的制備。將小鼠肝臟用冷生理鹽水洗去浮血，拭干。于肝左葉取材4塊，每塊大小約為1.5 cm×1.5 cm×0.4 cm，立即用10%中性甲醛固定；經70%，90%，95%，100%乙醇脫水；無水乙醇與二甲苯混合液（V∶V=1∶1） 中30 min，再移入二甲苯中15～20 min；移入二甲苯與石蠟混合液（V∶V=1∶1），在60℃恒溫箱中放置30 min，再移入融化的石蠟中浸蠟；將浸蠟的組織塊置于包埋框內的石蠟中包埋；用切片機制成厚度在4 μm的切片；HE染色法染色；用顯微鏡觀察并拍照[9-10]。

本組研究對象為2016年7月~2017年6月期間在血站無償獻血的2063名獻血者,根據《獻血者健康檢查要求》,以上獻血者的身體條件與之符合,精神疾病、傳染性疾病以及血液病患者均不在研究之列。將2017年上半年無償獻血的1063名無償獻血者作為觀察組。觀察組獻血者男女比例為545/518,最高齡55歲,最低齡20歲,平均年齡(32.4±4.1)歲。將2016年下半年無償獻血的1000名獻血者作為對照組。對照組獻血者男女比例為511/489,年齡22~54歲,平均年齡(31.5±4.7)歲。兩組無償獻血者的基本資料對照相仿(P>0.05),本研究具有可行性。

（2）分級方法。肝組織病變程度參照1981年國際病理學組確定的ALD組織學診斷標準：①肝細胞脂肪變：0分（＜5%），1分（5%～33%），2分（34%～66%），2分（34%～66%），3分（＞66%）；②小葉內炎癥（20倍鏡計數壞死灶）：0分（無），1分（＜2個），2分（2～4個），3分（＞4個）；③肝細胞氣球樣變：0分（無），1分（少見），2分（多見）；④肝纖維化分期（0～4）：0，無纖維化；1，肝腺泡3區輕度竇周纖維化；2，肝腺泡3區竇周纖維化合并門脈周圍纖維化；3，橋接纖維化；4，高度可疑或確診肝硬化，包括NASH合并肝硬化、脂肪性肝硬化和隱源性肝硬化[11-10]。

1.8 結果判定

在小鼠急性肝損傷模型成立的前提下，GSH、MDA和TG指標中任何二項和肝組織病理結果為陽性，可判定受試樣品對酒精性肝損傷有輔助保護功能[12-14]。

1.9 數據分析

采用SPSS V11.0統計軟件進行統計分析，數據用平均值±標準偏差表示，使用t檢驗比較組間差異的顯著性（p＜0.05或0.01）。

2 結果與討論

2.1 野西瓜提取物對小鼠體重的影響

野西瓜提取物對小鼠體重的影響見表1。

表1 野西瓜提取物對小鼠體重的影響

各處理組1 d的體重沒有顯著性差別，在14，28 d的體重與對照組比較，差異無統計學意義（p＞0.05）。因此，在28 d的給藥過程中，野西瓜提取物對小鼠體重無顯著性影響。

2.2 野西瓜提取物對肝組織中MDA，GSH和TG含量的影響

肝損傷是多因素參與的復雜過程，乙醇是試驗性肝損傷模型的常用藥物，對肝臟具有較強的損傷作用，可導致肝細胞的變性、壞死、脂肪變性、纖維化和癌變。研究顯示，在乙醇進入體內經肝激酶P450激活產生過氧自由基和氧自由基，這些自由基會使生物膜脂質發生過氧化反應，與膜上脂質及蛋白質分子進行不可逆結合，造成脂肪酸異常代謝，進而引起肝組織中MDA和GSH降低，引起肝彌漫性壞死和炎癥癥狀[11，14-16]。表2顯示野西瓜提取物對小鼠肝臟組織中MDA和GSH含量的影響。MDA作為脂質過氧化的最終產物，其含量增多表明脂質過氧化反應增強，而GSH是一種抗氧化劑，能有效地還原氫過氧化物自由基生成相應醇，達到阻斷或減輕過氧自由基和氧自由基所致的脂質過氧化鏈鎖反應的目的[11，13]。試驗結果顯示，模型組的MDA顯著高于對照組，GSH顯著低于對照組，差異均有統計學意義(p＜0.01)，因而乙醇引起的小鼠急性肝損傷建模成功。在建模成功的前提下，中劑量組和高劑量組的GSH均顯著高于模型組，MDA顯著低于模型組（p＜0.05）。因此，中劑量和高劑量的野西瓜提取物具有降低MDA含量、升高GSH含量的作用。

TG表征肝臟組織中甘油三酯積聚情況，在脂肪酸代謝被阻斷或減緩時，會出現含量升高的情況。試驗結果顯示，在小鼠急性肝損傷建模成功的前提下，低劑量、中劑量和高劑量組的TG含量均顯著低于模型組的含量（p＜0.01）。因此，低劑量、中劑量和高劑量組的給藥均促進小鼠的脂肪代謝。

野西瓜提取物對小鼠肝臟組織中MDA，GSH，TG含量的影響見表2。

表2 野西瓜提取物對小鼠肝臟組織中MDA，GSH，TG含量的影響

2.3 野西瓜提取物對小鼠肝組織病理的影響

野西瓜提取物對小鼠肝組織病理的影響見圖2。

圖2 野西瓜提取物對小鼠肝組織病理的影響

結果顯示，對照組細胞以中央靜脈為中心，向四周呈放射狀排列，細胞壁均勻，肝小葉結構完整，中央靜脈和肝血竇無充血水腫，未見干細胞變性和壞死；而模型組細胞排列松弛，出現肝細胞氣球樣變形態，有多處壞死灶，其中以肝小葉中央區域最為嚴重，出現部分脂肪變性；與模型組相比，隨著給藥劑量增加，肝細胞脂肪變性和水樣變性明顯減少，壞死病灶明顯減少，其中以高劑量作用最為顯著，高劑量組的肝細胞組織均勻，細胞核清晰，較接近于對照組。

進一步對小鼠肝臟組織切片進行分析，按照肝細胞脂肪變性、小葉內炎癥、肝細胞氣球樣變和肝纖維化4個方面對其進行分析總結，計算處理組的平均積分。模型組肝臟組織積分顯著高于對照組，差異有統計學意義（p＜0.01），證明小鼠急性肝損傷模型成立。中劑量和高劑量組肝臟組織積分明顯低于模型組。

野西瓜提取物對小鼠肝組織病理的影響見表3。

2.4 野西瓜提取物功能性組分檢測

表3 野西瓜提取物對小鼠肝組織病理的影響

采用HPLC的方法檢測野西瓜提取物中葫蘆素組分，將樣品的HPLC圖譜分別與葫蘆素A、葫蘆素B和葫蘆素E的標準品HPLC圖譜比對，結果發現野西瓜提取物含有葫蘆素A，未檢出葫蘆素B和葫蘆素E，葫蘆素A的含量為25.6 nM/kg果實，野西瓜提取物中葫蘆素A的純度為10%。

野西瓜提取物液相色譜見圖3。

圖3 野西瓜提取物液相色譜

現代藥理研究表明葫蘆素具有抗腫瘤、抗菌消炎、抗人類免疫缺陷病毒、保肝、提高機體免疫力等藥理活性[17]。前期研究顯示甜瓜蒂中葫蘆素B和葫蘆素E對CCl4或酒精引起的肝損傷均顯示保護作用，研究使用的劑量介于0.2～6.0 mg/kg，并推測葫蘆素B是通過恢復載脂蛋白功能將甘油三酯以β-脂蛋白形式排出體外，從而對肝損傷起到保護作用[11，15，16，18]。從分子結構上方面分析，葫蘆素A，B和E均屬于四環三萜類同系物，其區別在于葫蘆素A比葫蘆素B在C9位上的甲基上多1個羥基，比葫蘆素E在C1和C2之間少1個雙鍵（圖4）。推測葫蘆素A在功能上與葫蘆素B和葫蘆素E具有相似之處。因此，葫蘆素A可能是野西瓜提取物對肝損傷的保護作用功效成分之一。

葫蘆素A，B和E的分子結構見圖4。

圖4 葫蘆素A，B和E的分子結構

3 結論

以野西瓜提取物對小鼠灌胃28 d，采用誘導的小鼠急性肝損傷模型，結果發現按照2.0，3.5 mg/kg的野西瓜提取物給藥28 d，即中劑量組和高劑量組，對小鼠的體重沒有顯著性影響，顯著降低小鼠肝組織MDA和TG含量、升高GSH含量，差異有統計學意義（p＜0.01），同時，肝組織病理分析顯示中劑量組和高劑量組肝臟組織積分明顯低于模型組。野西瓜提取物（2.0～3.5 mg/kg） 對由乙醇誘導的小鼠急性肝損傷具有保護作用。進一步的分析結果顯示，葫蘆素A可能是野西瓜提取物中的主要功能性成分。