結核感染T細胞斑點試驗在結核性胸膜炎患者中假陰性的危險因素分析

鄒興武， 周 華， 符一騏， 周建英

結核性胸膜炎由結核分枝桿菌（MTB）通過淋巴、血行或胸膜下肺部結核病灶直接蔓延至胸膜，引起胸膜介導的免疫反應，產生胸腔積液引起的。在單側胸腔積液病原菌中MTB占30%～60%。結核性胸膜炎缺乏典型的臨床表現和影像學特征，傳統的實驗室診斷方法陽性檢出率低，而逐漸開展的胸膜活檢或胸腔鏡檢查屬于有創性檢查，特別對老年患者應用有一定限制，對結核性胸膜炎的早期診斷有一定的局限性[1-2]。結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）是一種針對結核感染的體外診斷試驗，該方法應用MTB的RD1區域編碼早期分泌抗原靶蛋白-6（ESAT-6）和培養濾過蛋白-10（CFP-10）作為特異性抗原，檢測外周血效應T細胞經過抗原刺激后分泌γ干擾素的情況。結核病患者中，T-SPOT.TB的總體靈敏度85.0%，特異度92.5%。由于它無法區分活動性結核與潛伏結核感染，目前認為其陰性結果時，臨床首選排除結核病診斷[3-4]。文獻報道高齡、服用非甾體藥物、外周血單個核細胞減少等因素會造成T-SPOT.TB假陰性[5-8]。本文以特定的結核性胸膜炎患者為研究對象，對影響T-SPOT.TB假陰性的可能危險因素進行篩選及分析，以期提高T-SPOT.TB試驗在結核性胸膜炎中的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取浙江大學醫學院附屬第一醫院2014年1月－2015年6月收治住院的診斷為結核性胸膜炎并行T-SPOT.TB檢查的患者。診斷標準參照中華人民共和國衛生行業標準WS 288—2017版；臨床診斷病例：結核性胸膜炎患者，胸水表現為滲出液、腺苷脫氨酶（ADA）升高。同時具備下列條件之一者：結核菌素皮膚試驗中度陽性或強陽性、干擾素釋放試驗陽性、MTB抗體陽性，并排除其他肺部疾病。確診病例：①胸水病原學檢查，符合涂片顯微鏡檢查陽性或分枝桿菌培養陽性，菌種鑒定為MTB復合群；②胸膜病理學檢查符合結核改變者。排除標準：①年齡＜18歲；②病例資料不齊；③隨訪不足12個月；④培養結果為非結核分枝桿菌；⑤長期使用激素；⑥HIV感染者；⑦患有免疫系統疾病。共有239例患者納入研究，根據T-SPOT.TB的檢測結果，分為假陰性組和陽性組。T-SPOT.TB假陰性組33例患者中，男24例，女9例，年齡平均（55.6±17.0）歲；合并肺外結核8例（24.2%），其中結核性腹膜炎2例、結核性心包炎5例、腸結核1例。T-SPOT.TB陽性組206例患者中，男137例，女69例，平均（41.1±17.7）歲；合并肺外結核11例（5.3%），其中結核性腹膜炎7例、結核性心包炎2例、結核性腦膜炎1例、結核性盆腔炎1例。本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

收集患者的臨床特征及實驗室數據等進行單因素分析。將P＜0.05的單因素納入兩組間多因素logistic回歸分析，同時將年齡按青年組（18～39歲）=1、中年組（40～59歲）=2、老年組（60歲以上）=3賦值設置虛擬變量進行分層分析。由于部分患者入院后因胸水量少，未行胸水常規、生化檢查，為提高多因素logistic回歸分析統計意義，未將胸水的相關檢驗值納入多因素logistic回歸分析。

T-SPOT.TB的實驗室操作：采用Oxford Immuunotec Ltd的T-SPOT.TB試劑盒并嚴格按照試劑盒說明進行，肉眼觀察結果，計數著色的斑點。以任一個ESAT-6或CFP-10檢測孔達到以下標準判定為陽性：如果陰性對照孔斑點數＜5個，以檢測孔斑點數減去陰性對照孔斑點數≥6為陽性； 如果陰性對照孔斑點數為6～10個，以檢測孔斑點數≥2倍的陰性對照孔斑點數為陽性，如果上述標準不符合且陽性對照孔正常時檢測結果為陰性。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0統計分析軟件。臨床數據符合正態分布的以均數±標準差表示，不符合正態分布以中位數（四分位數間距）或相應例數表示，用兩獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney U檢驗來比較分析組間指標。計數資料采用頻數及百分數表示，兩組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，均以P＜0.05為差異具有統計學意義。多因素分析采用logistic逐步回歸。

2 結果

2.1 與T-SPOT.TB假陰性結果相關的單因素分析

單因素分析發現年齡、吸煙、飲酒、入院前病程、抗結核治療、T-SPOT.TB檢查前給予胸腔抽液檢查、合并肺外結核、血紅蛋白、外周血淋巴細胞計數、外周血單核細胞計數、胸水白細胞計數、胸水淋巴細胞百分比、胸水總蛋白、胸水ADA與T-SPOT.TB假陰性結果存在顯著相關（表 1）。

表1 結核性胸膜炎患者中T-SPOT.TB假陰性危險因素的單因素分析Table 1 Univariate analysis of the risk factors for false negative result of T-SPOT.TB test in patients with tuberculous pleurisy

2.2 與T-SPOT.TB 假陰性結果相關危險因素多因素logistic回歸分析

在單因素分析的基礎上，將年齡、血紅蛋白、外周血淋巴細胞計數、入院前時間、既往肺結核、抗結核治療、T-SPOT.TB檢查前給予胸腔抽液檢查、吸煙、飲酒和合并肺外結核采用多因素偏最大似然估計法逐步logistic回歸分析發現年齡是獨立危險因素。對年齡進行分層分析后發現，隨年齡的增長，出現T-SPOT.TB假陰性的風險越高。另外T-SPOT.TB檢查前曾行胸腔抽液檢查、抗結核治療、合并肺外結核是T-SPOT.TB假陰性的獨立危險因素。而外周血淋巴細胞計數是T-SPOT.TB假陰性的保護因素，提示外周血淋巴細胞數量越多，發生假陰性的風險越小，淋巴細胞減少是T-SPOT.TB假陰性的獨立危險因素（表2）。

表2 結核性胸膜炎患者中T-SPOT.TB假陰性危險因素的多因素logistic回歸分析結果Table 2 Multivariate logistic regression analysis of the risk factors for false negative result of T-SPOT.TB test in patients with tuberculous pleurisy

3 討論

新發肺結核患者中伴有結核性胸膜炎者占4.7%～17.6%[9]。該疾病常常急性起病，胸膜纖維化等并發癥發生率較高。因此該疾病的早期診斷、及時有效的治療對改善患者預后有重要的意義。近年來，T-SPOT.TB檢測技術因其較高的靈敏度和特異度，在結核性疾病的診斷中得到廣泛關注。該技術是使用MTB特異性抗原刺激外周血T淋巴細胞，應用酶聯免疫斑點方法，對能分泌γ干擾素的抗原特異性效應T淋巴細胞進行計數，從而判斷結核感染狀態，缺點是無法區分活動性結核與潛伏結核感染，臨床工作中陰性結果更有意義。所以近年來，對其假陰性影響因素的研究受到人們的關注。2009年Liao等[7]報道在肺結核患者中高齡和接受激素治療是T-SPOT.TB假陰性的危險因素 ，2013年Lee等[8]對128例肺外結核患者的研究中發現僅結核性腦膜炎與T-SPOT.TB假陰性有關，而年齡、性別、HIV感染、是否合并肺結核等因素無統計學意義 。2015年Pan等[5]再次的大樣本研究結果顯示，在肺結核患者中年齡、超重、發病時間＞6個月，在肺外結核患者中高齡是T-SPOT.TB假陰性的危險因素 。總之，目前T-SPOT.TB假陰性影響因素的相關研究較少，且未有針對某一類型結核性疾病的研究，難以個體化應用于臨床。

本文采用多因素logistic回歸分析發現在結核性胸膜炎患者中年齡、外周血淋巴細胞數量、合并肺外結核、抗結核治療是T-SPOT.TB試驗假陰性結果的獨立危險因素。隨著年齡的增長，T-SPOT.TB假陰性的概率逐漸升高，結合國內外相關研究，分析其可能的機制是隨著年齡的增長，人體固有免疫和適應性免疫能力均相對下降，而T細胞作為免疫反應過程中的重要部分，其增殖、分化、分泌細胞因子等生物學能力也相應下降[10]。結核性胸膜炎是一種依賴于T細胞的免疫反應，當機體免疫水平下降時，在結核抗原刺激下不能產生有效免疫應答，因此隨著年齡的增長，淋巴細胞對抗原的應答能力下降是導致T-SPOT.TB靈敏度受損的主要原因。

本研究顯示，外周血淋巴細胞數量也與T-SPOT.TB的假陰性有關。一般來講，淋巴細胞的數量可反映機體的免疫能力，當淋巴細胞總數減少時，產生的細胞因子也相應減少，機體的免疫效力降低，在一定程度上對多種疾病的診療和預后有較好的提示意義。當結核桿菌感染機體時，經抗原提呈細胞處理后MTB致敏T淋巴細胞，T淋巴細胞快速增殖、分化，成為發揮功能的效應性T細胞，因此淋巴細胞數，尤其是T淋巴細胞的數量和功能均有可能成為T-SPOT.TB的檢測結果的影響因素。T-SPOT.TB檢查時統一將送檢樣本中單個核細胞數量進行標化處理，調整為標準細胞濃度，一定程度上糾正了細胞數量對檢驗結果的影響。然而研究顯示，結核性胸膜炎患者外周血淋巴細胞數量越多，發生假陰性的比例越小，T淋巴細胞的數量變化在此過程的意義仍需進一步分析完 善。

臨床工作中，對胸腔積液患者，常行胸腔抽液檢查，抽取胸水后，結核性胸膜炎患者再行T-SPOT.TB檢查的假陰性率會升高，差異有顯著統計學意義。在結核性胸膜炎中，機體的免疫細胞受感染局部細胞因子的趨化作用在胸腔聚集，胸腔積液中的單個核細胞數量較外周血單個核細胞（PBMC）顯著增多，抗原特異性T細胞的數量可能達到PBMC中的15倍[11-12]。推測抽取胸腔積液后，在局部病灶的刺激下機體會再次分泌胸腔積液，抗原特異性T細胞繼續向胸膜腔遷移加劇外周血抗原特異性細胞比例失調。如前所述，T-SPOT.TB檢測的是體外分泌γ干擾素的抗原特異性效應T淋巴細胞，當外周血的效應T細胞減少時，一定程度上會影響T-SPOT.TB的敏感性。有報道多種漿膜腔積液（如肺泡灌洗液、腹水等）中也有類似表現，即感染局部的T細胞數量顯著高于外周血[13-14]。這可能解釋了當患者合并多漿膜腔積液時容易出現假陰性的原因。T-SPOT.TB假陰性組中，大部分患者合并的肺外結核為多漿膜腔積液，僅有1例腸結核患者，仔細分析發現該患者存在中重度營養不良，初步推測T-SPOT.TB假陰性可能與營養不良引起免疫受損有關。而當患者抗結核治療后，體內的MTB逐漸被清除，而結核抗原特異性效應T細胞隨之減少甚至消失，因此均有可能出現T-SPOT.TB的假陰性結果[15]。此外，Lee等[6]也發現T-SPOT.TB陽性結果與外周血抗原載體數量密切相關 。

本研究在單因素分析中發現，胸腔積液中淋巴細胞比例在兩組患者之間具有顯著差異，由于部分患者就診時已經出現了胸膜粘連或者胸水很少，通過胸腔鏡病理診斷而明確，無胸腔積液檢驗結果，為提高統計效能，因此沒有進一步進行多因素回歸分析，期待在更大樣本中進行觀察分析。兩組中胸腔積液ADA無統計學差異可能也與樣本數較少有關。

綜上分析，結核性胸膜炎患者中高齡、外周血淋巴細胞數量減少、胸腔抽液檢查、多部位肺外結核、抗結核治療會導致T-SPOT.TB試驗假陰性概率升高，可能與機體的免疫功能下降和外周血中效應T淋巴細胞減少有關。提示在臨床工作中需要慎重對待T-SPOT.TB陰性結果，尤其遇到高齡、外周血淋巴細胞減少癥、多部位肺外結核、T-SPOT.TB檢查前給予胸腔抽液檢查和抗結核治療期間的結核性胸膜炎患者。