重癥監護室流行耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥機制及同源性分析

蘇珊珊， 宮 雪， 張吉生， 包名家， 王 勇， 李慧玲， 張曉麗

近年來，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）在全世界范圍內廣泛流行，以耐藥性強、致死率高、具有傳播性且難以治療為特點，引起人們的廣泛關注。了解其耐藥及毒力的分子機制，對于控制CRKP的傳播至關重要。本文研究佳木斯大學附屬第一醫院入住重癥監護室（ICU）患者CRKP的耐藥機制、同源性及序列分型，以期為臨床抗感染治療和隔離預防提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及鑒定藥敏

收集我院2016年4－12月分離自ICU的CRKP 16株，剔除同一患者的重復菌株，實驗前重新鑒定。其中14株分離自痰液，2株分離自血液。藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。VITEK 2-Compact全自動微生物分析儀及配套的藥敏卡（GN和GN13）進行菌株鑒定及藥敏分析。采用亞胺培南、美羅培南、厄他培南、阿米卡星、環丙沙星和左氧氟沙星紙片進行紙片擴散法對CRKP藥敏進行結果的復核，選取對亞胺培南、美羅培南或厄他培南至少一種藥物耐藥者，參照CLSI 2016年M100-s26版進行藥敏結果判讀。紙片購自英國OXIOD公司。

1.2 表型鑒定

改良Hodge試驗（MHT）[1]，根據CLSI指南要求進行試驗并對結果進行判讀；改良碳青霉烯滅活試驗（mCIM）[1]，根據CLSI指南要求進行操作，當菌懸液浸泡過的美羅培南紙片抑菌圈直徑為6～15 mm或抑菌圈內有散在菌落但直徑為16～18 mm，即為mCIM試驗陽性。

表1 PCR引物序列Table 1 The primers and corresponding sequence used in PCR

1.3 耐藥基因、血清型及毒力基因檢測及測序

采用聚合酶鏈反應（PCR）法檢測耐藥基因。煮沸法提取菌株DNA。檢測的耐藥基因包括碳青霉烯酶：blaKPC、blaNDM、blaIMP-1、blaIMP-8、blaVIM-1、blaVIM-2、blaOXA-48； ESBL耐藥基因：blaSHV、blaTEM、blaCTX-M-1、blaCTX-M-9；AmpC酶：blaDHA；血清型基因：K1、K2、K5、K20、K54、K57；毒力基因：magA、rmpA、uge、wcaG、aero、allS、mrkD、kpn、fimH、iroNB，引物序列見表1[2-10]，上海生工生物公司合成。總反應體系25 μL：Go Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，細菌模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循環30次，72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，擴增產物送哈爾濱博仕生物公司雙向測

序，測序結果在BLAST上比對確定基因型。

表1 （續）Table 1（continued）

1.4 同源性分析

采用腸桿菌科基因間重復一致序列PCR（ERIC-PCR）進行同源性分析，引物序列為ERIC-2：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'，反應條件及反應體系參照文獻合成[4]，擴增產物后用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，并用紫外凝膠成像系統進行拍照分析，只要條帶數目及位置完全相同計為同一型。

1.5 多位點序列分型（MLST）

選取肺炎克雷伯菌的7個管家基因gapA、mdh、pgi、infB、rpoB、tonB、phoE進行擴增，引物設計和反應條件參照http：//www.pasteur.fr/公布的數據。擴增產物送哈爾濱博仕生物公司測序，結果上傳至數據庫http://bigsdb.pasteur.fr進行比對分型。

2 結果

2.1 ICU患者入院情況

患者年齡層次偏大，大于50歲的占81.3%，患者有較重的心腦血管疾病或腹部損傷及細菌感染，入院天數較長，平均入院時間27.3 d，均有長期應用多種抗菌藥物史，病死率50.0%，見圖1。

圖1 ICU患者流行病學分析Figure 1 Epidemiological analysis of ICU patients

2.2 藥物敏感試驗結果

16株CRKP對氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南、亞胺培南、厄他培南、美羅培南、慶大霉素、妥布霉素均耐藥，對阿米卡星、左氧氟沙星保持較高的敏感率，見表2。

表2 16株CRKP對抗菌藥物的藥敏結果Table 2 Antimicrobial susceptibility of the 16 strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

2.3 碳青霉烯酶表型檢測結果

16株CRKP改良Hodge試驗均為陽性，15株CRKP mCIM陽性。

2.4 耐藥基因及毒力基因檢測結果

16株CRKP主要攜帶碳青霉烯酶及超廣譜β內酰胺酶（ESBL）基因，其中A類碳青霉烯酶KPC-2、CTX-M-1、SHV占100%，15株產TEM（93.8%），1株產B類金屬酶NDM-5（6.3%）。16株CRKP菌株血清型均為陰性，但攜帶mrkD、fimH、kpn、uge毒力基因，陽性率均為100%。本次實驗并未檢出IMP-4、IMP-8、VIM-1、VIM-2、ACC、OXA-48、CTX-M-9、DHA、K1、K2、K5、K20、K54、K57、magA、rmpA、wcaG、aero、alls、iroNB基因，見表3。陽性基因見圖2。

2.5 同源性分析和分型

ERIC-PCR同源性分析結果：16株CRKP均含有相同的DNA指紋圖譜，為A型（圖3）。MLST分型結果：通過對肺炎克雷伯菌7個管家基因進行分析，16株CRKP均為ST76型。見圖3。

3 討論

我院ICU從2016年4－12月，共檢出16株CRKP，且均為ST76型，ERIC為同一型別，說明有小范圍流行。肺炎克雷伯菌ST76型很少報道，曾見于上海及南昌[11-12]， 不同于國內主要流行株ST11型。上海市兒童醫院在2016年的一次暴發流行中分離出ST76型CRKP，并未導致患者死亡，而我院感染ST76型CRKP患者病死率達到50.0% ，高病死率可能與患者嚴重的基礎疾病和并發癥密切相關[13]。16例ICU患者有較重的心腦血管疾病、外傷及嚴重感染，在住院期間曾有青霉素類、頭孢菌素類、β內酰胺酶抑制劑、喹諾酮類等抗菌藥物治療史，其中6例患者也曾用過碳青霉烯類藥 物。

抗菌藥物敏感試驗顯示僅對阿米卡星、左氧氟沙星保持較高的敏感率，對其余抗菌藥物耐藥率較高，與深圳的一篇報道相似[14]。16株菌攜帶KPC-2基因，1株攜帶NDM-5基因，全部菌株都含有3種及以上耐藥基因型，有研究指出碳青霉烯酶和ESBL基因可以通過質粒接合進行轉移[5，11]，可見CRKP的多重耐藥是多基因共同作用的結果，并通過質粒在醫院環境中水平傳播，與其他報道一致[15]，使得臨床治療變得更加困難。

表3 CRKP耐藥基因攜帶情況Table 3 Resistance genes carried by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains

圖2 耐藥基因陽性電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of the resistance genes identified from carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains

圖3 部分CRKP的ERIC-PCR電泳圖Figure 3 Electrophoretogram of ERIC-PCR products amplified from carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains

2007年，我國發現首例產KPC-2型肺炎克雷伯菌，隨后在北京、天津、上海、江蘇、浙江、甘肅迅速播散[16]。KPC基因是腸桿菌中檢出率最高的碳青霉烯酶， 攜帶KPC基因的CRKP已經成為患者死亡的獨立危險因素[17]。本實驗檢出16株CRKP均為產KPC-2酶的菌株，推斷本次流行為攜帶KPC-2基因的菌株引起病房內廣泛傳播。2010年有雜志報道了1株攜帶新德里1型（NDM-1）的“超級細菌”[18]，引起人們廣泛關注，隨后許多國家相繼報道，2013年我國報道了第1例攜帶NDM-1基因的CRKP[11]。NDM-5是NDM酶的一個亞型，有報道顯示其對碳青霉烯類抗生素的耐藥性比NDM-1更強[19]。NDM-5基因易存在于大腸埃希菌，在肺炎克雷伯菌中表達的報道很少[20]。本次實驗發現1株產NDM-5酶的CRKP，有厄他培南藥物應用史。有報道顯示ST76型僅在產KPC酶菌株中存在[21]，國內報道的ST76型CRKP為攜帶NDM-1和NDM-5基因[11-12]，而我們分離的菌株主要攜帶KPC-2基因，同時發現1株攜帶KPC-2和NDM-5基因，是否存在2種耐藥質粒，我們將進行更深層次的研究。

有研究指出黏液表型編碼基因（rmpA）和需氧菌素基因（aero）陽性可認為是高毒力肺炎克雷伯菌，比拉絲試驗準確率更高[22]，本研究這兩個基因均為陰性，提示目前我院ST76型CRKP不具備高毒力特征。至今肺炎克雷伯菌至少已有78種血清型，其中K1、K2被認為是重要的毒力血清型[23]，本實驗6個常見血清型均為陰性，不排除有其他血清型存在的可能。我們的結果中mrkD、fimH、kpn檢出率100%，fimH-1主要編碼I型菌毛黏附基因，mrkD主要編碼III型菌毛黏附基因，kpn類似fi mH-1的黏菌素基因，均與細菌黏附相關，使菌體易黏附在呼吸道、泌尿道上皮增加感染的機會，多藥耐藥的肺炎克雷伯菌存在高黏附特性，給治療帶來挑戰，也可能是本研究死亡率高導致治療失敗的主要原因之一。

綜上，我院ICU分離出ST76型CRKP，主要攜帶KPC-2基因，并出現小范圍流行。應加強對ICU的監測，發現耐藥菌株盡快隔離，加強醫護人員手部衛生及對耐藥菌處理的相關知識，控制耐藥菌的水平傳播，加強抗菌藥物管理、CRKP篩查和定期監測，減少醫院感染的發生。