FAK抑制劑TAE226作用于人舌鱗癌細胞過程中波形蛋白的表達研究

鄒湘渝　曾琴　劉萍

【摘要】 目的：探討黏著斑激酶（focal adhesion kinase ，FAK）抑制劑TAE226對人舌鱗狀細胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）細胞株Tca8113中波形蛋白（Vimentin）的表達是否有抑制作用及其意義。方法：FAK抑制劑TAE226作用于Tca8113細胞，分別培養24 h、48 h、72 h，采用實時熒光定量PCR技術檢測Vimentin mRNA的表達情況。結果：與對照組比較，Vimentin mRNA的相對表達量均顯著下降，實驗組與對照組在各個時間點上Vimentin mRNA的表達差異均有統計學意義（P <0.05），并呈現出劑量-效應依賴性與時間-效應依賴性（P<0.05）。當TAE226作用72 h時，0.5 μmol /L組、1 μmol/L組、5 μmol/L組和10μ mol/L組的Vimentin mRNA的相對表達量分別是對照組的0.51倍、0.41倍、倍、0.24倍和0.12倍，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：TAE226可以抑制舌鱗癌細胞株Tca8113中Vimentin的表達，這可能在TAE226抑制人舌鱗癌細胞侵襲和轉移過程中扮演重要角色。

【關鍵詞】 TAE226； 黏著斑激酶； 舌鱗狀細胞癌； 波形蛋白

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.18.004 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2018）18-000-03

The Expression of Vimentin in Human Tongue Squamous Cell Carcinoma Cells Acted by Focal Adhesion Kinase Inhibitor TAE226/ZOU Xiangyu，ZENG Qin，LIU Ping，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（18）：-11

【Abstract】 Objective：To study whether TAE226（a focal adhesion kinase inhibitor） could inhibit the expression of Vimentin in human tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 and its significance.Method：Tca8113 cells were cultured with TAE226.On hour 24，48，72，RT-PCR was conducted to detect the expression of Vimentin.Result：Compared to the control group，the expression level of Vimentin in the experimental groups decreased（P<0.05）.The relative expression differences of the experimental groups and control groups at all time points showed statistically significant（P<0.05）.When TAE226 worked 72 h，the relative expressions of Vimentin in 0.5 μmol/L group，1 μmol/L group，5 μmol/L group and 10 μmol /L group had dropped 0.51 times，0.41 times，0.24 times and 0.12 times respectively（P<0.05）.Conclusion：TAE226 can effectively inhibit the expression of Vimentin in human tongue cell line Tca8113，which may play an important role in the invasion and metastasis of TAE226 inhibiting human tongue squamous cell carcinoma.

【Key words】 TAE226； Focal adhesion kinase； Tongue squamous cell carcinoma； Vimentin

First-authors address：The Hospital of Stomatology Southwest Medical University，Luzhou 646000，China

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma， OSCC，簡稱口腔鱗癌）是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，同時也是世界第六常見的惡性腫瘤，是世界范圍內癌癥發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。局部浸潤和遠處轉移是OSCC難治性與致死性的根本原因，因此阻斷癌前病變突破基底膜轉化為浸潤癌（即侵襲生長），是實現口腔鱗癌早期防治的關鍵。TAE226是一種二苯胺基吡啶化合物，是目前公認的針對黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）的ATP競爭性酪氨酸激酶抑制劑，可以有效阻斷FAK信號通路。隨著研究的深入，人們發現TAE226能抑制口腔癌、卵巢癌、食管癌、結腸癌、乳腺癌、人神經母細胞瘤等多種惡性腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力及血管生成[2-3]。本實驗通過定量RT-PCR法檢測TAE226作用于人舌鱗癌Tca8113細胞后波形蛋白（vimentin） mRNA的表達變化并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

Tca8113細胞株，西南醫科大學口頜面修復重建和再生實驗室提供；TAE226，Selleck 上海藍木化工有限公司；優質胎牛血清，北京索萊寶生物科技有限公司；RPMI1640培養液，賽默飛世爾生物化學制品有限公司；PBS，北京索萊寶生物科技有限公司；DMSO，美國AMRESCO；RNA提取試劑盒，TIANGEN生化科技有限公司；逆轉錄試劑，日本TOYOBO公司；QuantiFast ?SRBR? Green PCR Kit，德國QIAGEN公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 TAE226的配制及實驗分組 將TAE226溶解于DMSO 20 mmol/L（在Z-VAD-FMK試管中加入107 μl的DMSO，稀釋成20 mmol/L液體），于-20 ℃冰箱中分裝保存。臨用前按比例稀釋。本實驗將配制成TAE226終濃度為0.5、1、5、10 μmol/L的培養液作為實驗組，配制含相同體積比例的DMSO的培養液為對照組。

1.2.2 實時熒光定量RT-PCR檢測 Tca8113細胞株由含10%胎牛血清、青霉素100 μg/ml、鏈霉素100μg/ml及RPMI-1640培養基配制的培養液于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。Tca8113細胞按5×105/ml的密度接種于六孔板，待細胞完全貼壁后，去除廢液，PBS沖洗，并分別加入TAE226（0、0.5、1、5、10μmol/L）的培養液3 ml/孔，搖勻，置于孵箱中培養。分別在培養24、48、72 h后，按試劑盒說明書裂解細胞提取總RNA，并于微量分光光度計上檢測RNA純度及濃度，逆轉錄合成cDNA并擴增Vimentin RNA。反應體系：總RNA模板2 ?l

（1 ?g），蒸餾水6.4 μl，?SRBR? Green Real time PCR Master Mix 10 ?l，上游引物0.8 μl，下游引物0.8 μl。設置三個復孔，擴增條件為：95 ℃預變性，30 s；95 ℃變性30 s；57 ℃退火10 s；72 ℃延伸15 s，共40個循環。RT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成，見表1。以目的基因的相對表達量=2-ΔΔCT計算出各基因的相對表達水平，其中ΔCt=CT（目的基因）-CT（內參基因），ΔΔCt=ΔCT（實驗組）-ΔCT（對照組）。上述實驗重復三次。

1.3 統計學處理

實驗結果采用SPSS 17.0統計學軟件分析。計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用重復變量方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

與對照組比較，加入TAE226后，Vimentin mRNA的相對表達量都顯著下降，實驗組與對照組在各個時間點上mRNA的表達差異均有統計學意義（P<0.05），呈現出劑量-效應依賴性與時間-效應依賴性（P<0.05）。取各對照組Vimentin mRNA的相對表達量為1，則10 μmol/L組mRNA的表達均低于5 μmol/L組、1 μmol/L組、0.5 μmol /L組（P<0.05），且72 h 10μmol/L組的Vimentin mRNA較對照組下降了約0.12倍（P<0.05），見圖1和表2。

3 討論

口腔鱗狀細胞癌是最常見的惡性腫瘤之一，而舌鱗狀細胞癌，簡稱舌鱗癌又是最常見的口腔頜面部惡性腫瘤[4]，其生物學行為惡劣，早期即可發生淋巴結轉移，嚴重威脅著人類健康[5]。腫瘤轉移為受多種促轉移基因和轉移抑制基因調控的復雜過程，其中腫瘤細胞侵襲是腫瘤轉移的前提，有必要對其相關分子機制進行深入研究。FAK是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶，是細胞內重要的骨架蛋白與多種信號通路的關鍵分子。它在整合生長和細胞基質黏附信號方面具有關鍵作用，是癌癥侵襲和轉移的主要驅動力[6-7]。相關研究發現，FAK在口腔鱗癌中高表達，且與口腔鱗癌的侵襲能力呈正相關關系，目前已成為研究抗腫瘤藥物的重要靶點之一。而TAE226是目前發現的一種針對FAK的強效抑制劑[7]。Kurio等[8]研究發現TAE226可抑制人類口腔鱗狀細胞癌SAS細胞的增殖、遷移和侵襲，且經TAE226處理后的口腔鱗癌細胞伴有肌動蛋白纖維和細胞黏附喪失。Vimentin是一種進化上保守的中間纖維蛋白，人類波形蛋白的編碼基因位于染色體10p13，作為一種重要的骨架蛋白維持細胞的完整性，與細胞骨架構成和細胞黏附密切相關。波形蛋白是間質細胞的標志物，主要表達于間充質，在正常上皮組織中并不表達[9]。但近年研究發現波形蛋白在上皮來源的腫瘤如乳腺癌、肝癌、腎上腺癌、胃癌、直腸癌、宮頸癌等中異常表達，并參與腫瘤的侵襲和轉移過程[10]，因此通過分子生物學的方法阻止腫瘤中波形蛋白的過表達降低腫瘤的侵襲性，從而為腫瘤的分子靶向治療開辟了一條新道路。

本課題組前期研究中發現，1μmol/L TAE226對Tca8113細胞的增殖、遷移、侵襲已有明顯的抑制效果，在本實驗中，TAE226作用下的人舌鱗癌Tca8113細胞中間質標志物Vimentin mRNA表達下降，且TAE226劑量越大，作用時間越長，Vimentin mRNA的相對表達量則越低，TAE226抑制了人舌鱗癌細胞中Vimentin的表達。有研究發現，腫瘤在侵襲轉移的過程中，Vimentin可表達在上皮源性的腫瘤細胞的胞質內，賦予了上皮源性細胞成纖維細胞樣的特征，使細胞更易于遷移和運動，細胞之間黏附連接能力下降，遷移、侵襲和轉移能力增強，發生上皮-間質轉變（EMT），后者是癌變侵襲轉移的首要步驟，嚴重影響病變的預后，因此Vimentin已經成為上皮源性腫瘤預后的重要指標[11-12]。因此，可以推測TAE226抑制Vimentin的表達，降低細胞遷移和運動能力，增強細胞的黏附能力，進而抑制細胞的侵襲和轉移。

綜上所述，TAE226，作為FAK的強效抑制劑之一，能抑制人舌鱗癌細胞中Vimentin的表達，這可能在TAE226抑制舌鱗癌細胞的遷移、侵襲和轉移過程中起著重要作用。由于腫瘤侵襲轉移的機制十分復雜，本課題組將在波形蛋白及EMT信號通路方面進一步實驗研究以探討TAE226的抗腫瘤機制，為進一步探索口腔腫瘤的防治策略提供參考。

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（收稿日期：2018-01-19）