霧化吸入滅活草分枝桿菌對膿毒癥急性肺損傷大鼠精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶—1表達的影響

齊心欣　顧忠民　陳超

【摘要】 目的：觀察膿毒癥肺損傷大鼠肺組織精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶-1（coac-tivator-associated arginine methyltransferase 1，CARM-1）、核因子-kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein box-1，HMGB1）、血清降鈣素原（procalcitonin，PCT）的水平，探討霧化吸入滅活草分枝桿菌治療膿毒癥肺損傷機制。方法：選取48只清潔級健康雄性Wistar大鼠隨機分成假手術(shù)組（Sham組）、膿毒癥肺損傷組（CLP組）、草分枝桿菌F.U.36注射液霧化吸入治療組（F.U.36組），每組16只，于術(shù)后24、48 h分別檢測HMGB1、PCT濃度及免疫組織化學(xué)檢測CARM-1、NF-κB表達，光鏡觀察肺組織病理變化。結(jié)果：CLP組術(shù)后48 h死亡2只，F(xiàn).U.36組術(shù)后48 h死亡1只，Sham組無死亡；CLP、F.U.36組術(shù)后24、48 h時的PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB濃度均高于Sham組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；F.U.36組術(shù)后24、48 h時的PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB濃度均顯著低于CLP組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；光鏡下CLP組和F.U.36組可見肺損傷，CLP組較F.U.36組損傷明顯。結(jié)論：霧化吸入滅活草分枝桿菌可降低膿毒癥肺損傷時相關(guān)炎癥因子水平，對肺有保護作用。

【關(guān)鍵詞】 滅活草分枝桿菌； 膿毒癥； 肺損傷； 精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶-1

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.16.080 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2018）16-0-03

膿毒癥常引起急性肺損傷，其臨床病死率高，目前認為與多種炎癥介質(zhì)有關(guān)，但發(fā)病機制仍未明確[1]。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶-1（coac-tivator-associated arginine methyltransferase 1 CARM-1）是蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶11個家族成員之一，目前發(fā)現(xiàn)其與心血管、呼吸等多種疾病有關(guān)[2]，但其在膿毒癥肺損傷中的作用未見報道。研究認為草分枝桿菌（Mycobacterium phlei，M.ph）細胞壁、多糖等成分有免疫調(diào)節(jié)功能，草分枝桿菌F.U.36注射液作為滅活M.Ph制劑，目前已應(yīng)用于臨床[3]，但其是否可減輕膿毒癥肺損傷，目前未見報道。故筆者通過實驗比較膿毒癥肺損傷大鼠霧化吸入草分枝桿菌F.U.36注射液后，肺組織CARM-1、核因子-kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein box-1，HMGB1）及血清降鈣素原（procalcitonin，PCT）的水平變化，探討其減輕膿毒癥大鼠肺損傷機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

48只清潔級健康雄性Wistar大鼠，體重（190±20）g（上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK滬，2012-0002），利用隨機數(shù)字表獲取隨機數(shù)字，按1∶1∶1隨機分三組，即假手術(shù)組（Sham組）、膿毒癥肺損傷組（CLP組）、草分枝桿菌F.U.36注射液霧化吸入治療組（F.U.36組），每組16只。

1.2 試劑及儀器

草分枝桿菌F.U.36注射液（成都金星健康藥業(yè)公司，規(guī)格1.72 μg/支），大鼠CARM-1、NF-κB及DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），大鼠HMGB1及PCT試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技公司），10%水合氯醛溶液及10%甲醛溶液（上海江萊生物公司），空氣壓縮式霧化吸入治療器（廣東粵華醫(yī)療器械廠，型號WH-2000），電動玻璃勻漿器（寧波新芝，型號DY89-1），離心機（常州市萬豐儀器制造有限公司，型號TD5A），酶標儀（美國AWARENESS公司，型號Stat Fax 2100），石蠟切片機（浙江金華益迪試驗器材，型號YD-315），光學(xué)顯微鏡（廈門麥克奧迪公司，型號BA-210T）等。

1.3 方法

1.3.1 給藥方法 參考Carpenter等[4]實驗并予改進：將大鼠置入除底蓋的礦泉水瓶中，露頭于瓶頸外，尾端封上；向霧化器藥杯中加人5 ml生理鹽水（CLP組和Sham組）、草分枝桿菌F.U.36注射液（按照60 kg體重成人用量1.72 μg換算成大鼠等效劑量0.172 μg/kg，稀釋于5 ml生理鹽水）（F.U.36組），將霧化器給藥管扣住大鼠口鼻霧化，直至藥液霧化完，約需30 min[4]。各組霧化1次/d，連續(xù)霧化5 d。

1.3.2 模型制作 各組大鼠在最后一次霧化結(jié)束后24 h行膿毒癥造模，參照Hubbard等方法：CLP組和F.U.36組予10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，于腹正中做長2 cm的手術(shù)切口進入腹腔，將盲腸拉出，絲線結(jié)扎盲腸中段，扎線下0.5 cm處用國產(chǎn)25號針頭穿透腸壁1次，形成漏口兩處，擠壓糞便流出，將盲腸回納，逐層縫合關(guān)腹[5]。Sham組同法麻醉后開、關(guān)腹，不予盲腸結(jié)扎穿孔。三組術(shù)后均皮下注射平衡液50 ml/kg，術(shù)后正常飲水、進食。

1.3.3 標本采集 術(shù)后24、48 h三組各取8只大鼠麻醉后開腹抽取腹腔動脈血1 ml，待自然凝固后于1 h內(nèi)3 000 r/min離心15 min，分離上層血清置-80 ℃冰箱保存待測PCT；開胸腔，完全分離肺部，取80mg肺組織制成勻漿，3 000 r/min離心15 min后分離上清液置-80 ℃冰箱保存以測HMGB1；取部分肺組織迅速放入10%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋切片以待免疫組織化學(xué)檢測CARM-1、NF-κB和病理檢查。

1.3.4 觀察項目與檢測方法 （1）大鼠肺組織HMGB1及血清PCT濃度測定：嚴格按照各試劑盒說明書要求，采用ELISA方法檢測。（2）大鼠肺組織CARM-1、NF-κB免疫組織化學(xué)檢測：取肺組織石蠟切片，予脫蠟、熱修復(fù)抗原，孵育一抗，4 ℃過夜，孵育二抗，DAB顯色，各級酒精（60-100%）脫水，封片，光鏡觀察免疫組織化學(xué)反應(yīng)的強度及分布；通過IPP6.0圖像分析軟件，計算各組CARM-1、NF-κB的平均吸光度值（A值）。（3）大鼠肺組織病理學(xué)檢查：取肺組織石蠟切片，脫蠟后行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺病理結(jié)構(gòu)改變。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

CLP組死亡2只（術(shù)后48 h死亡2只），F(xiàn).U.36組死亡1只（術(shù)后48 h死亡1只），Sham組無死亡。死亡原因與膿毒癥大鼠盲腸缺血壞死面積、腹腔滲出多、感染重等有關(guān)。

2.2 三組大鼠術(shù)后24、48 h PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB濃度比較

三組大鼠術(shù)后24、48 h PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB濃度比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。CLP、F.U.36組術(shù)后24、48 h時PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB濃度均高于Sham組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；F.U.36組術(shù)后24、48 h時PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB濃度均顯著低于CLP組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3 三組大鼠肺組織病理分析

Sham組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，上皮細胞排列緊密，未見腫脹、壞死；CLP組可見上皮細胞排列紊亂伴壞死，大量炎性細胞浸潤，肺泡內(nèi)細胞滲出；F.U.36組上皮細胞變性壞死程度較輕，炎性細胞浸潤相對較輕，肺泡滲出較輕，見圖1、圖2。

3 討論

研究證實滅活M.Ph及其活性組分通過模式識別受體信號通路，影響免疫細胞功能基因表達[3]。相關(guān)研究提示霧化吸入草分枝桿菌F.U.36可改善支氣管哮喘氣道炎癥反應(yīng)[6]，其具有用藥劑量小、副作用少等特點，而是否減輕膿毒癥肺損傷反應(yīng)目前未見報道，故本實驗予以探討。

PCT已成為膿毒癥診斷指標之一，近來研究提示其與嚴重感染的臟器功能障礙程度相關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)CLP組PCT水平明顯增高，同期肺組織病理損傷明顯，提示血清PCT水平高低反映出膿毒癥肺損傷病情。F.U.36治療組PCT水平較CLP組顯著下降，肺部損傷較輕，提示霧化吸入草分枝桿菌F.U.36可下調(diào)其水平而減輕膿毒癥肺損害。

研究認為胞外HMGB1可激活多種炎性細胞，加重組織壞死，是膿毒癥重要的晚期炎癥因子[8]，但其在膿毒癥肺損傷中的作用研究極少。本研究發(fā)現(xiàn)CLP組HMGB1水平顯著上升，同期肺病變嚴重，提示其參與了膿毒癥肺損傷過程。目前認為HMGB1阻斷療法能減輕敗血癥、缺血再灌注損傷等疾病模型病情，可能成為治療炎癥和自身免疫疾病新方向[9]。本研究發(fā)現(xiàn)草分枝桿菌F.U.36可下調(diào)HMGB1水平從而改善肺部病情。

CARM-1在胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用，目前研究發(fā)現(xiàn)其在支氣管哮喘、肺癌等疾病的發(fā)展中扮演重要角色[10]。研究發(fā)現(xiàn)CARM-1是NF-κB激活的必需因子，其啟動了胞內(nèi)NF-κB信號傳導(dǎo)通路，促進炎性基因表達[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)CLP組CARM-1及NF-κB水平明顯增高，同期肺病變明顯，提示二者參與了膿毒癥肺損傷過程。F.U.36組二者水平有明顯下降，肺部病變較輕，提示草分枝桿菌F.U.36可下調(diào)其水平而減輕膿毒癥性肺損害。

研究發(fā)現(xiàn)HMGB1通過與TLR4結(jié)合，激活下游NF-κB誘導(dǎo)各種炎癥因子的釋放，NF-κB為重要的早期炎性因子，其與晚期炎性因子HMGB1在膿毒癥的發(fā)展過程中存在正反饋機制[12]。本實驗觀察到CLP組HMGB1因子和信號通路蛋白CARM-1及NF-κB濃度明顯增高，提示膿毒癥時相關(guān)因子協(xié)同促進了肺損傷過程，而草分枝桿菌F.U.36通過降低相關(guān)因子水平減輕了膿毒癥肺損傷。

本研究提示膿毒癥急性肺損傷時，血清PCT、肺內(nèi)HMGB1等炎癥因子水平增高，肺內(nèi)CARM-1、NF-κB等炎癥信號傳導(dǎo)因子表達增強，提示相關(guān)因子參予了膿毒癥肺損傷過程，炎癥因子與通路蛋白間存在正反饋關(guān)系。霧化吸入滅活草分枝桿菌通過降低膿毒癥相關(guān)炎癥因子及通路蛋白水平而起到減輕肺損害作用。

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（收稿日期：2017-12-28）