臍帶間充質干細胞治療心臟擴大伴心力衰竭類心肌病病兒的效果

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(青島大學附屬婦女兒童醫院，青島市婦女兒童醫院,山東 青島 266034 1 心臟中心； 2 兒童超聲科； 3 重癥醫學中心)

擴張型心肌病(DCM)是一種以單心室/雙心室球形擴大，并且伴有進行性心臟收縮功能減退的疾病[1]。小兒心肌病年發病率為(1.24～1.31)/10萬，而DCM占其中一半以上，是引起兒童心力衰竭(簡稱心力衰竭)的重要原因之一[2]。約40% DCM病兒后期合并心力衰竭，最終不得不接受心臟移植，或者在診斷后的2年內面臨死亡[3]。目前該病主要的治療方法包括藥物治療、心臟起搏器置入以及心室減容成形術等[4]，但都不能從根本上解決心肌細胞再生及心肌功能重建等問題[5]。臍帶間充質細胞(UC-MSCs)的治療為DCM伴有心力衰竭的病兒提供了一種嶄新的及有益的嘗試[6]。人UC-MSCs(hUC-MSCs)是成體干細胞的一種，具有較高自我更新能力[7]，其來源豐富，具有多向分化潛能及移植后不良反應少等優點[8]，是移植的“種子細胞”的理想來源。本研究通過對心肌病伴心力衰竭病兒接受hUC-MSCs治療前后臨床、相關檢查及實驗室指標的觀察，評估hUC-MSCs對心肌病伴心力衰竭病兒的臨床治療效果，旨在為干細胞的治療提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入標準：①確診心臟擴大伴有心力衰竭的心肌病，如DCM、心室肌致密化不全、心內膜彈力纖維增生癥；②NYHA分級為Ⅱ～Ⅳ級或者具有等同于Ⅱ～Ⅳ級的癥狀；③左心室射血分數>20%；④已給予至少1次大劑量丙種球蛋白治療，效果不佳；⑤治療年齡為1月齡～18周歲；⑥病兒和(或)病兒家屬簽署知情同意書。排除標準：①具有持續性室性心動過速或顫動病史者；②植入心臟除顫器者；③潛在的心臟除顫器候選者；④其他：有暈厥病史、5年內患有腫瘤、活動性感染性疾病以及病毒性疾病實驗陽性者等。本研究在clinicaltrails.gov網站注冊編號為NT01219452，已報經醫院倫理委員會批準。

符合入選條件的病兒共17例，男9例，女8例。其中診斷為DCM者4例，心肌致密化不全者12例，心內膜彈力纖維增生癥者1例。NYHA心功能分級Ⅱ級者10例，Ⅲ級者5例，Ⅳ級者2例。初診年齡為1～144個月，平均為(44.23±48.32)個月；hUC-MSCs治療前的病程為3～120個月，平均為(29.29±27.03)個月。細胞治療前存在端坐呼吸者5例，口唇發紺者2例；心臟聽診聞及奔馬律者4例，肝臟腫大者4例，雙下肢水腫者2例。細胞治療前心電圖存在多導聯ST-T改變者17例，其中期前收縮(房性或室性)者4例，傳導阻滯者4例。17例病兒均常規給予強心、利尿和擴血管藥物治療，所用藥物為地高辛、雙氫克尿噻或呋塞米、安體舒通、卡托普利或苯那普利；細胞治療前，15例(88.2%)心肌病病兒給予β受體阻斷劑(美托洛爾或卡維地洛)治療，其療程為1～120個月，平均(23.7±13.2)個月。17例病兒均給予丙種球蛋白治療1～4次，其總劑量為2～6 g/kg；10例(58.8%)病兒給予激素治療，其療程為12～48個月，平均(25.9±12.2)個月。所有病兒細胞治療前常規給予左卡尼丁口服液、維生素B1、維生素B2及輔酶Q10等治療。

1.2 hUC-MSCs來源

hUC-MSCs由青島奧克生物開發公司生產并提供，1 U hUC-MSCs含有1×107個細胞，流式細胞儀檢測細胞表型為CD34(-)、CD45(-)、CD90(+)、CD105(+)、HLA-DR(-)，符合間充質干細胞表型特征；乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋體、支原體、巨細胞病毒和HIV檢測均陰性；需氧菌培養和真菌培養陰性。

1.3 方法

hUC-MSCs的應用方法為肌肉注射，選取雙上肢三角肌和雙下肢股四頭肌各1處為注射點；根據病兒年齡不同，每次肌肉注射劑量為0.5～1.0 U，每個月應用1次，連續給予2～3次。細胞治療期間病兒繼續應用抗心力衰竭等基礎治療藥物，所用藥物有地高辛、雙氫克尿噻或呋塞米、安體舒通、卡托普利或苯那普利、左卡尼丁口服液、維生素B1、維生素B2及輔酶Q10等。

1.4 觀察指標

細胞治療后觀察以下指標。①臨床指標為臨床癥狀，無癥狀生存時間、存活和死亡人數及存活者心功能。存活者心功能評價標準：NYHA提高2級及以上為明顯好轉，NYHA提高1級及以上為好轉，NYHA無提高或惡化為無好轉。②心臟超聲指標為左心室射血分數、左心室短軸縮短率、左心室舒張末期內徑和左心室收縮末期內徑。③實驗室指標為氨基未端腦鈉肽前體(NT-proBNP)。

1.5 安全性觀察指標

觀察病兒細胞治療后有無體溫波動、惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、感染等；注射局部有無腫脹、鈣化、新生腫物及感染；心電圖或動態心電圖觀察有無新的心律失常發生；實驗室檢測血常規(白細胞、血紅蛋白、血小板)、尿常規(尿紅細胞、尿白細胞、尿蛋白)和肝腎功能改變(谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮和肌酐)。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 病兒治療后NYHA心功能的變化

細胞治療后，病兒明顯好轉者4例(23.5%)，好轉者11例(64.7%)，無好轉者2例(11.8%)，病兒總體心功能改善(u=-3.637，P<0.05)。NYHA分級由Ⅳ級轉為Ⅱ、Ⅲ級者各1例；Ⅲ級轉為Ⅰ級者3例，轉為Ⅱ級者2例；Ⅱ級轉為Ⅰ級者8例； Ⅱ級無改善者和轉為Ⅲ級者各1例，此2例病兒均存在難以控制的反復呼吸道感染。

2.2 病兒治療后生存質量情況

至本次隨訪結束，總隨訪時間為7～74個月，平均隨訪時間為(31.5±30.27)個月，最長隨訪時間為74個月。17例心肌病病兒于細胞治療后均存活，目前均口服抗心力衰竭基礎藥物；其中13例病兒臨床無任何心力衰竭癥狀，參加同年齡組兒童的日常活動，如上學或進幼兒園，其生存時間為3～28個月，平均生存時間為(13.8±10)個月；4例病兒仍存在心力衰竭癥狀，其中輕度端坐呼吸者1例，肝臟腫大者2例，雙下肢水腫者1例，日常活動輕度受限，不能參加同年齡組兒童的日常活動，其生存時間分別為7、13、32以及74個月，平均生存時間為(31.5±33.5)個月。

2.3 病兒治療前后外周血NT-proBNP水平及心臟超聲的變化

hUC-MSCs治療后14例病兒NT-proBNP水平由治療前(697±693)ng/L下降至治療后(200±141)ng/L，治療前后比較，差異有顯著性(t=2.641，P<0.05)。3例病兒因反復呼吸道和(或)消化道感染，心功能無明顯好轉，NT-proBNP多次復查處于較高水平，其中1例細胞治療后較治療前明顯升高，心功能分級惡化；1例病兒細胞治療前后無明顯變化，心功能分級無改善；1例病兒細胞治療后較治療前明顯下降，但仍處于較高水平，心功能分級好轉。

hUC-MSCs治療后病兒左心室射血分數由治療前(37.2±10.9)%提高到(45.4±13.0)%，治療前后比較，差異具有顯著意義(t=-2.910，P<0.05)，其中12例病兒治療后的左心室射血分數由治療前(35.6±9.8)%提高到(49.6±12.2)%，差異有顯著性(t=-6.196，P<0.05)；5例病兒的左心室射血分數治療后無升高，其中3例較治療前無變化，但其心功能分級有所好轉；2例較治療前下降，心功能分級惡化或無改善。

hUC-MSCs治療后病兒左心室短軸縮短率由治療前(19.4±6.2)%升高至(22.6±7.3)%，但治療前后比較，差異無顯著性(P>0.05)；其中11例病兒由治療前(18.0±5.0)%升高至(24.8±7.2)%，治療前后比較，差異有顯著性(t=-5.648，P<0.05)；6例病兒較細胞治療前無升高，其中2例較治療前下降，心功能分級惡化或無改善；2例稍有下降；2例無變化，但其心功能分級有所好轉。

hUC-MSCs治療后病兒左心室舒張末期內徑由治療前(51.2±10.4)mm縮小至(48.1±11.8)mm，治療前后比較，差異具有顯著意義(t=2.591，P<0.05)；其中11例由治療前(49.7±10.4)mm縮小至(44.4±10.8)mm，治療前后比較，差異具有顯著性(t=3.689，P<0.05)；6例較治療前無縮小，其中2例較治療前增大，心功能分級惡化或無改善；4例無明顯變化，但其心功能分級有所好轉。

細胞治療后病兒左心室收縮末期內徑由治療前(41.3±12.0)mm縮小至(37.1±13.0)mm，治療前后比較，差異具有顯著性(t=2.805,P<0.05)；其中13例病兒治療后由治療前(43.9±12.4)mm縮小至(37.8±14.6)mm，治療前后比較，差異具有顯著性(t=3.718,P<0.05)；4例病兒較治療前無縮小，其中2例較治療前增大，心功能分級惡化或無改善；2例無變化,但其心功能分級有所好轉。

2.4 安全性

17例心肌病病兒細胞治療后的1周內，尤其是48 h之內出現面頰和口唇紅潤，部分病兒出現多汗，無發熱、皮疹、惡心、嘔吐、腹瀉等。肌肉注射部位未見紅腫、出血、發硬及腫脹等異常。1例6歲病兒細胞治療后右側腹股溝斜疝自愈。細胞治療后病兒心電圖明顯改善，表現為ST-T壓低改善，2例室性期前收縮及2例房性期前收縮病兒期前收縮次數明顯減少，傳導阻滯消失；未合并感染的病兒無新發心律失常出現；僅1例病兒因合并重癥感染出現陣發性室上性心動過速、頻發室性期前收縮，經抗感染、抗心律失常治療后心律失常消失，目前心電圖僅見多導聯ST-T段改變。細胞治療前后外周血白細胞計數、血紅蛋白、血小板計數、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮及肌酐均未見明顯升高或者降低(P>0.05)。見表1。細胞治療前1例合并感染病兒白細胞計數偏高，1例合并急性心力衰竭和感染的病兒存在肝腎功能損害，表現為谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮、肌酐值增高，余15例病兒上述指標均在正常范圍；細胞治療后2個月及隨訪結束時上述指標均在正常范圍。細胞治療前后監測尿蛋白、尿白細胞和尿潛血均為陰性。

3 討 論

近年來，有關干細胞臨床治療的研究越來越多，而且逐漸傾向于有關間充質干細胞應用研究[9-10]。UC-MSCs是間充質干細胞的一種，其來源于包繞臍帶血管的結締組織——華爾通膠(WJ)[11]，具有以下優點：具有干細胞的多項分化潛能[7]；取材方便，來源豐富，倫理爭議少；低免疫原性，移植相關排斥反應小，安全性高[12]。這些優點使其成為臨床應用治療多種系統疾病的很好的選擇[9]。目前多項研究表明，UC-MSCs在心臟修復及心臟疾病治療中具有較高的安全性及有效性，是移植的“種子細胞”的理想來源[13-14]。

既往我們已經對hUC-MSCs治療DCM進行了相關的實驗研究，研究對象為正常大鼠及DCM大鼠，發現肌肉注射hUC-MSCs對正常大鼠無影響，主要表現為注射前后心臟結構、功能以及心肌相關細胞因子的水平無明顯變化[15-16]，大鼠內臟各器官(肺、肝、脾、腦、腎、肌肉)結構無異常，大鼠血常規、血生化及尿常規亦無明顯變化，大鼠生活習性以及生長發育無明顯的變化[17]；肌肉注射hUC-MSCs對DCM大鼠有一定的影響，表現為增加心肌組織胰島素樣生長因子、肝細胞生長因子、血管內皮生長因子等細胞因子的表達，促進心肌微血管再生，減輕心肌組織病理損傷，改善心肌組織超微結構，從而使心功能改善，并具有一定的免疫調節功能[18-20]。以上動物實驗研究為hUC-MSCs的臨床應用提供了有效性及安全性證據。

表1 病兒治療前后血常規和肝腎功能指標比較

目前UC-MSCs治療心肌病的相關臨床研究報道較少,FISHER等[21]將干細胞應用于慢性缺血性心臟病的治療，ISHIGAMI等[22]發現冠狀動脈內注射干細胞治療單心室改變的心臟病，可以改善心臟功能，PINCOTT等[23]報道了骨髓來源的干細胞應用于成人DCM的治療；FANG等[24]將hUC-MSCs應用于缺血性心臟病患者治療效果的研究。這些研究均顯示干細胞可應用于心臟疾病的治療，可部分改善部分病人的心功能。目前相關的研究認為，hUC-MSCs治療心肌病的可能機制如下：①替代作用，hUC-MSCs誘導后分化為心肌細胞，移植至體內替代病變心肌[25]；②自分泌或旁分泌功能，分泌血管生成因子、生長因子、細胞因子等物質，從而改善心肌功能[26]；③抗低氧誘導心肌凋亡功能[27]；④免疫調節功能[28]；⑤促進血管再生功能；⑥激活內源性心臟干細胞，從而促進心肌修復[29]。

本研究結果顯示，肌注hUC-MSCs可改善部分心肌病伴心力衰竭病兒的臨床癥狀及心功能，表現為活動耐力提高，可實現無癥狀生存，左心室射血分數提高，左心室舒張末期內徑、左心室收縮末期內徑減小；肌注hUC-MSCs后無明顯不良反應，安全性較好，肌注部位無明顯異常，且未發現hUC-MSCs移植相關的血常規異常、肝腎功能損害、惡性心律失常等。但本研究樣本較少，隨訪時間較短，尚需要多中心、大樣本、前瞻性的病例對照研究進一步明確其有效性和安全性。