采后苯并噻重氮處理對‘玉金香’甜瓜氨基酸代謝酯類香氣物質及其代謝機理的影響

王 博，李霽昕，李經緯，王 雨，胡妍蕓，蔣玉梅,*

‘玉金香’甜瓜是甘肅省特色經濟作物之一，屬呼吸躍變型水果，貯藏運輸過程中因后熟快、易受病原菌浸染而易失去商品價值[1-2]。化學誘抗劑苯丙噻重氮（benzothiadiazole，BTH）可誘導甜瓜果實產生抗病性，降低病原菌侵染率，延長果實貨架期[3-4]。果實香氣可反映商品風味、成熟度及品質[5]，其構成是評價果實品質的重要指標[6-7]。酯類、醛類、醇類及含硫化合物是甜瓜香氣的主要構成[8-9]，分別來自于以脂肪酸為前體的脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）代謝和以氨基酸、單糖、糖苷為前體的代謝[10-11]。采后BTH誘抗處理可提高甜瓜果肉和果皮組織的LOX活力，影響以脂肪酸為前體的LOX代謝，抑制甜瓜香氣物質釋放[12]。關于采后BTH處理對以氨基酸為前體的香氣代謝影響機理研究目前鮮見報道。

酯類香氣物質的氨基酸代謝包括轉氨基和脫羧基過程，氨基酸通過轉氨基過程形成支鏈酮酸，脫羧或脫氫后生成支鏈醛和酰基-CoA，進而在醇脫氫酶和醇酰基轉移酶的催化下形成支鏈酯類香氣物質[13-14]；由支鏈氨基酸、芳香族氨基酸和含硫氨基酸代謝衍生形成的醛、醇和酯類是構成植物香氣的重要組分[15]。轉氨酶和丙酮酸脫氫酶是轉氨基和脫羧基過程的關鍵酶[16]。

以‘玉金香’厚皮甜瓜為實驗原料，在采后常溫貯藏期間，監測樣品氨基酸含量、谷丙轉氨酶（glutamate pyruvic transaminase，GPT）、谷草轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）、丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase，PDC）和丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）活力及其代謝產物酯類香氣物質含量的變化，探討采后BTH誘抗處理對氨基酸代謝酯類香氣物質的影響及其代謝機理，以期為甜瓜采后病害控制機理及其對果實香氣代謝影響機理的研究提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘玉金香’甜瓜于花后45 d采摘于甘肅省皋蘭縣什川鎮露天栽培大田，單果發泡網袋包裝（40 個/箱），當天運達甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室。

BTH（純度98%）、2-辛醇（色譜純） 美國Sigma Aldrich公司；GPT、GOT試劑盒 蘇州科銘生物公司；PDC和PDH酶聯免疫吸附劑測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海酶聯生物公司。

1.2 儀器與設備

TRACE1300GC-ISQ300氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀、TG-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.5 μm）、Multiskan GO全波長酶標儀 美國Thermo Scientific公司；DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）固相微萃取頭 美國SUPELCO公司；L-8900氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 前處理

參照李軒[17]的方法，選擇成熟度和大小相近、無損傷和蟲咬的果實，分別用100 mg/L BTH溶液（BTH處理組）、蒸餾水（條件對照組，CC組）浸泡10 min，以未處理果實為對照組（CK組）。在（22±2）℃、相對濕度55%～65%條件下貯藏待測。

貯藏第0、2、4、6、8、10、12天在各組隨機抽取外觀相近、無損傷的‘玉金香’果實各10 個，取果實“赤道”部位果肉、果皮組織（皮下5 mm），切小塊混勻。用于測定氨基酸含量和酶活力的樣品（約5.0 g）用錫箔紙包裹液氮冷凍，于－80 ℃保存；用于測定香氣物質含量的樣品（5.0 g）置于20 mL頂空瓶，加1.0 g NaCl、50 μL 1.64 g/L內標2-辛醇，混勻密封，－20 ℃保存待測。

1.3.2 氨基酸含量的測定

參考王頡等[18]的方法，取5.0 g樣品冰浴研磨，加10 mL體積分數5%的磺基水楊酸溶液，12 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清液，過膜，L-8900氨基酸分析儀測定氨基酸含量。采用外標法定性定量分析。

1.3.3 香氣物質含量的測定

參照蔣玉梅等[19]的方法并進行修改。樣品室溫解凍后40 ℃水浴平衡30 min，用250 ℃活化的固相微萃取頭40 ℃頂空吸附30 min。GC進樣口解析10 min后進樣分析。

GC條件：進樣口溫度240 ℃，不分流進樣，20 min后開分流閥，分流比30∶1；高純度He，流速1.0 mL/min；初溫50 ℃保持3 min，3 ℃/min升至170 ℃（保持10 min）；檢測器溫度250 ℃。

MS條件：傳輸線溫度180 ℃，電子轟擊電離，70 eV，離子源溫度240 ℃，質量掃描范圍m/z 40～250。

定性定量：計算機檢索NIST Library（11）、Wiley Library，結合人工圖譜解析；內標法半定量分析。

1.3.4 酶活力的測定

GPT和GOT活力的測定：參照王美英[20]的方法并進行修改，取2.0 g樣品于預冷研缽，加0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.2）8 mL，冰浴研磨勻漿，12 000 r/min 4 ℃離心20 min，上清液為粗酶液，分別滴入GPT和GOT試劑盒試劑，用酶標儀測定505 nm波長處吸光度，對照標準曲線確定酶活力。單位為μmol/（kg·min）。

PDC活力的測定：參照李巖[21]的方法并進行修改，取2.0 g樣品于預冷研缽，冰浴研磨勻漿，加入8 mL 4 ℃ 預冷提取液（85 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸緩沖液（pH 6.0）、5 mL二硫蘇糖醇、體積分數1%聚乙烯吡咯烷酮（crosslinking polyvingypyrrolidone，PVP）溶液），12 000 r/min 4 ℃離心15 min，上清液為粗酶液，采用PDC試劑盒檢測，用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度，對照標準曲線確定酶活力。單位為μmol/（kg·min）。

PDH活力的測定：參照李巖[21]的方法并進行修改，取2.0 g樣品于預冷研缽，冰浴研磨勻漿，加8 mL的分離提取液（50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.2）、0.25 mol/L蔗糖、5 mmol/L乙二胺四乙酸、4.5 mmol/L β-巰基乙醇、體積分數0.2% PVP溶液、體積分數0.1%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）溶液）。2 000 r/min 4 ℃離心10 min，過濾，于上清液中加入8 mL的清洗介質（含50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.2）、0.25 mol/L蔗糖、體積分數0.1% BSA溶液），懸浮浸提沉淀5 min，取上清液10 000 r/min 4 ℃離心5 min，過濾；沉淀用5 mL的清洗介質二次懸浮浸提5 min，2 000 r/min 4 ℃離心5 min，采用PDH試劑盒分析上清液，用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度，對照標準曲線確定酶活力。單位為μmol/（kg·min）。

1.4 數據處理

采用Excel 2010軟件計算平均值、標準差和繪制圖表。采用SPSS 19.0軟件進行顯著性（Duncan’s多重比較）和相關性分析（相關系數法），以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 BTH處理對果實氨基酸含量的影響

樣品中共檢測到15 種游離氨基酸。蘇氨酸和谷氨酸含量較高，其次是丙氨酸、甘氨酸、組氨酸和賴氨酸；半胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸和精氨酸含量較低（表1）。氨基酸總含量隨貯藏時間延長呈單峰型變化（圖1）。CK和CC組樣品氨基酸總含量在第6天達到最大值，BTH處理組的峰值則延遲2 d，其果皮和果肉樣品氨基酸總含量峰值分別為5 690、7 525 μg/g，分別是CK組的91.22%和90.08%，是CC組的92.57%和94.37%，BTH處理顯著抑制了氨基酸的積累（P＜0.05）；水處理對樣品氨基酸總含量有影響，但CC組與CK組氨基酸總含量差異不顯著（P＞0.05）。CK組果實（果皮+果肉）氨基酸總含量峰值出現在第6天，峰值為14 597 μg/g；BTH處理組果實氨基酸總含量峰值則延遲2 d，比CK組氨基酸總含量峰值降低了9.47%。果肉中氨基酸含量整體高于果皮，CK組果肉的峰值是果皮的1.34 倍。

圖1 BTH處理對甜瓜氨基酸總含量的影響Fig. 1 Effect of BTH treatment on amino acid contents in melon

已報道的參與果實香氣代謝的單體氨基酸前體主要包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和苯丙氨酸[11]。由表1可知，貯藏期間CK組果實中異亮氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸的含量峰值分別為74、57、176、1 205、166 μg/g和134 μg/g。BTH處理組果實中異亮氨酸的含量峰值比CK組低39.19%，其次是半胱氨酸、亮氨酸和丙氨酸，分別比CK組果實低24.56%、16.48%和5.15%。BTH處理組果實中纈氨酸和苯丙氨酸含量與CK組無明顯差異。

表1 BTH處理對果實（果皮＋果肉）中氨基酸含量的影響Table 1 Effect of BTH treatment on amino acid contents in fruit (peel + pulp)μg/g

表2 BTH處理對果實（果皮＋果肉）中支鏈、芳香族和含硫酯類香氣物質含量的影響Table 2 Effect of BTH treatment on the contents of branched-chain, aromatic and sulfur-containing aroma substances in fruit (peel + pulp)μg/g

2.2 BTH處理對果實氨基酸代謝酯類香氣物質含量的影響

‘玉金香’甜瓜樣品中，檢測到的氨基酸代謝酯類香氣物質包括支鏈酯類、芳香族酯類和含硫酯類物質，共10 種（表2）。貯藏期間，其酯類香氣物質含量（圖2）及各類酯類香氣物質含量（圖3）均呈單峰型變化。

圖2 BTH處理對甜瓜果實（果皮＋果肉）酯類香氣物質含量的影響Fig. 2 Effects of BTH treatment on the contents of aroma esters in melon fruit (peel + pulp)

由圖2可知，BTH處理組氨基酸代謝酯類香氣物質含量在貯藏第2～8天較CK和CC組果實低，釋放高峰較CK和CC組推遲2d。CK和CC組樣品釋放峰值分別為（14.473 3±1.311 9）μg/g和（13.424 3±1.362 0）μg/g，BTH處理組果實峰值為（11.708 8±1.083 4）μg/g，BTH處理組果實峰值分別比CK和CC組低19.10%、12.78%。釋放高峰后CK組釋放量高于CC組和BTH處理組，8 d后，CC組和BTH處理組釋放總量相近。

圖3 BTH處理對甜瓜支鏈、芳香族和硫酯類香氣物質含量的影響Fig. 3 Effect of BTH treatment on the contents of branched-chain,aromatic and thioester aroma substances in melon

由圖3A1、A2可知，BTH處理組果皮及果肉樣的支鏈酯類香氣物質含量采后2 d內下降，隨后上升，到達釋放高峰后再次下降。CK和CC組樣品的釋放高峰出現于第6天，BTH處理組的釋放高峰則推遲2 d。CK和CC組果皮樣釋放峰值分別為（1.433 7±0.137 7）μg/g和（1.493 4±0.139 3）μg/g，是BTH處理組釋放峰值的1.47 倍和1.51 倍；BTH處理組果肉樣釋放峰值為（1.487 4±0.155 4）μg/g，分別是CK和CC組峰值的58.08%和66.65%。

由圖3B1、B2可知，CK和CC組芳香族酯類香氣的釋放高峰出現于第6天。貯藏前8 d CK和CC組果皮樣品芳香族酯類香氣物質含量差異不明顯，隨后CC組低于CK組。BTH處理組果皮和果肉芳香族酯類香氣物質釋放高峰則分別被推遲至第10天和第8天。CK和CC組果皮樣釋放峰值分別為（2.808 5±0.283 5）μg/g和（2.770 9±0.244 9）μg/g，是BTH處理組的1.26 倍和1.24 倍；BTH處理組果肉樣釋放峰值為（5.657 0±0.398 9）μg/g，分別是CK和CC組釋放峰值的89.77%和102.10%。

由圖3C1、C2可知，果皮樣第0天未檢測到硫酯類香氣物質，CK和CC組樣品的釋放高峰出現于第8天，BTH處理組釋放高峰則推遲2 d，CK和CC組果皮硫酯類香氣物質釋放峰值分別為（0.607 6±0.095 6）μg/g和（0.517 7±0.084 6）μg/g，是BTH處理組釋放峰值的1.45 倍和1.24 倍。CK組和BTH處理組果肉硫酯類香氣物質釋放高峰出現在第8天，CC組釋放高峰在第4天，BTH處理組果肉樣品釋放峰值為（1.355 2±0.130 1）μg/g，分別是CK和CC組的99.61%和135.06%。

由此可見，BTH處理可抑制氨基酸代謝酯類香氣物質的釋放，延遲釋放高峰出現，釋放高峰前水處理對氨基酸代謝酯類香氣物質的釋放影響不顯著，之后有一定的抑制作用，第8天后，水處理的作用與BTH接近（圖2）。水處理會促進果皮樣品香氣釋放高峰前的支鏈酯類香氣物質和果肉樣品的含硫酯類香氣物質釋放（圖3A1、C2），釋放高峰之后水處理則一定程度上減少了各類酯類香氣物質的釋放，但無明顯作用規律。支鏈酯類香氣物質可賦予甜瓜果香和甜香感[22-23]，硫酯類主要賦予果實清香味[24]，而含量最多的芳香族酯類主要賦予果實花香味和生青味[22]。CK組果實支鏈酯類、芳香族酯類和硫酯類香氣物質的釋放峰值分別為（3.994 6±0.359 4）、（9.110 3±0.807 1）μg/g和（1.968 1±0.239 3）μg/g，與CK組相比，BTH處理組分別降低了37.95%、16.54%和17.36%，可見BTH處理對支鏈酯類香氣物質的釋放影響最明顯，由此可推斷BTH處理會顯著減弱甜瓜果香味和甜香感，而在一定程度上維持樣品的生青味，從而從香氣釋放的角度證明了BTH處理可延緩甜瓜的后熟進程。

2.3 BTH處理對氨基酸代謝酶活力的影響

圖4 BTH處理對甜瓜GPT、GOT、PDC和PDH活力的影響Fig. 4 Effect of BTH treatment on GPT, GOT, PDC and PDH activities in melon

氨基酸代謝酶GPT、GOT、PDC和PDH活力隨貯藏時間延長總體均呈單峰型變化趨勢（圖4）。由圖4A1、A2可知，BTH處理組GPT活力高峰出現在第8天，果皮樣品峰值為（37.77±1.60）μmol/（kg·min），分別比CK和CC組GPT活力峰值低3.60%和5.92%；CK組GPT活力高峰出現于第6天，CC組果皮樣品較其提前了2 d。CK和CC組果肉樣品GPT活力高峰均出現在第6天，分別為（23.84±0.99）μmol/（kg·min）和（25.03±1.23）μmol/（kg·min），BTH處理組為（23.42±1.23）μmol/（kg·min），各組樣品活力峰值差異不顯著。CK、CC組和BTH處理組果皮GPT活力峰值是果肉的1.64 倍、1.60 倍和1.61 倍。

由圖4B1、B2可知，BTH處理組的GOT活力高峰亦出現于第8天，果皮樣品GOT活力峰值為（27.48±1.80）μmol/（kg·min），分別比CK和CC組樣品低31.80%和24.80%。CK和CC組GOT活力高峰出現于第6天，果肉樣GOT活力峰值分別為（30.01±1.89）μmol/（kg·min）和（27.61±1.88）μmol/（kg·min），BTH處理組果肉GOT活力峰值比CK和CC組低19.10%和12.06%。CK、CC組和BTH處理組果皮的GOT活力峰值比果肉分別高出25.48%、24.44%和11.64%。

由圖4C1、C2可知，CK和CC組PDC活力高峰出現在第6天，BTH處理組PDC活力高峰被延遲2 d。BTH處理組果皮峰值為（70.08±3.07）μmol/（kg·min），分別比CK和CC組低16.86%和18.21%。CK和CC組果肉PDC活力峰值分別為（103.33±3.06）μmol/（kg·min）和（100.39±2.94）μmol/（kg·min），BTH處理組PDC活力峰值分別比CK和CC組低14.70%和12.21%。CK、CC組和BTH處理組果肉的PDC活力峰值是果皮的1.23、1.17 倍和1.26 倍。

由圖4D1、D2可知，BTH處理組PDH活力第8天最高，果皮峰值為（111.06±10.26）μmol/（kg·min），分別比CK和CC組低24.30%和26.95%，CK組活力高峰出現于第6天，CC組較其提前了2 d。CK和CC組果肉PDH活力高峰均出現于第6天，峰值分別為（188.32±10.99）μmol/（kg·min）和（180.22±11.23）μmol/（kg·min），BTH處理組較其分別低25.56%和22.21%。CK、CC組和BTH處理組果肉PDH活力較果皮樣分別高28.34%、18.56%和26.23%。

采后BTH處理可延遲GPT、GOT、PDC和PDH活力高峰出現，并抑制其活力，果皮GOT活力峰值被抑制最明顯，活力峰值比CK組樣品低31.80%，其次是PDH和PDC；果肉PDH活力峰值被抑制最明顯，活力峰值比CK組樣品低25.56%，其次是GOT、PDC。GPT和GOT果皮活力高于果肉，PDC和PDH果肉活力高于果皮。水處理可使果皮GPT和PDH活力高峰提前2 d出現，但與CK組相比，其對氨基酸代謝酶GPT、GOT、PDC、PDH活力峰值的影響不顯著。

2.4 氨基酸總含量、酶活力與氨基酸代謝酯類香氣物質含量相關性分析

CK組和BTH處理組氨基酸代謝酯類香氣物質含量與氨基酸總含量、酶活力相關性見表3，氨基酸總含量和GPT、GOT、PDC、PDH活力均與酯類香氣釋放量呈正相關。對于CK組，樣品氨基酸總含量、GOT活力與酯類香氣物質含量呈極顯著正相關（P＜0.01）；PDC活力與酯類香氣物質含量呈顯著正相關（P＜0.05）；GPT、PDH活力與酯類香氣物質含量相關性不顯著；氨基酸總含量與GPT、GOT和PDC活力呈極顯著正相關（P＜0.01），與PDH呈顯著正相關（P＜0.05）。BTH處理對氨基酸總含量、GOT活力與酯類香氣物質含量的相關性無影響，但會提高PDH活力與酯類香氣物質含量相關性（P＜0.05），而PDC活力與酯類香氣物質含量的相關性則被減弱；氨基酸總含量與GPT和PDC活力的相關性同樣被減弱。可見BTH可通過影響酯類香氣物質氨基酸代謝中各指標間的相關性改變氨基酸代謝酯類香氣物質的釋放。

表3 甜瓜果實（果皮+果肉）氨基酸總含量、相關酶活力與酯類香氣物質含量的相關性分析Table 3 Correlation analysis of amino acid content, related enzyme activities and aroma ester content in melon fruit (peel + pulp)

香氣物質2-甲基丁基酯類代謝前體異亮氨酸[25]含量在貯藏期間呈單峰型變化。采后BTH處理可抑制異亮氨酸在貯藏期間含量的變化，貯藏期間產物乙酸2-甲基丁酯含量變化及BTH對其的影響與異亮氨酸趨勢一致（圖5）。草莓的離體實驗顯示，加入異亮氨酸可促使2-甲基丁基酯含量增加2 倍[26]；對氘化的L-異亮氨酸追蹤分析可知L-異亮氨酸在蘋果中可轉化為相應的2-甲基丁基揮發性衍生物[27-28]；異亮氨酸對乙酸2-甲基丁酯的生物合成起重要作用[29]。同時，貯藏期間硫酯類香氣物質含量的變化及BTH對其的影響與半胱氨酸變化趨勢一致（圖6）。

圖5 BTH處理對異亮氨酸（A）及乙酸2-甲基丁酯（B）含量的影響Fig. 5 Effect of BTH treatment on the contents of isoleucine (A) and 2-methyl butyl acetate (B)

圖6 BTH處理對半胱氨酸（A）及硫酯類（B）含量的影響Fig. 6 Effect of BTH treatment on the contents of cysteine (A) and thioesters (B)

3 討 論

果實成熟過程中，游離氨基酸的變化與其生理代謝聯系緊密[18]。本實驗在‘玉金香’甜瓜中檢測到的15 種游離氨基酸貯藏期間變化趨勢與其代謝酯類香氣物質總體相同。唐貴敏[31]研究發現‘山農金黃一號’甜瓜香氣的形成隨氨基酸含量的增加而降低，‘Sweet Delight’甜瓜香氣物質含量形成隨著氨基酸含量的增加而升高。可見作為甜瓜香氣代謝前體物質之一的氨基酸對香氣物質代謝的影響因品種而異。本實驗所用‘玉金香’甜瓜氨基酸總量與酯類香氣物質含量呈極顯著正相關（P＜0.01）。BTH處理對實驗果實氨基酸總量及各類酯類香氣的釋放均有抑制作用，說明BTH可通過抑制氨基酸含量的降低從而抑制其代謝產物酯類香氣物質的釋放。貯藏期間，產物乙酸2-甲基丁酯含量變化與代謝前體異亮氨酸變化趨勢一致，產物含硫酯類香氣物質含量的變化與代謝前體半胱氨酸變化趨勢一致，進一步說明了采后BTH處理可通過影響代謝前體氨基酸的含量改變‘玉金香’甜瓜酯類香氣物質的釋放。

氨基酸通過轉氨酶作用形成支鏈酮酸，進而經過PDC或PDH形成支鏈醛和酰基-CoA。樣品采后BTH處理對GPT、GOT、PDC和PDH活力均有一定的抑制作用，其影響度依次為：GOT＞PDH＞PDC＞GPT。GOT活力與酯類香氣物質含量呈極顯著正相關（P＜0.01），貯藏期間酯類香氣物質含量變化與GOT活力變化趨勢相同，可見GOT活力對氨基酸酯類香氣代謝影響最大，是氨基酸代謝途徑的關鍵環節之一。程煥等[16]的研究結果也表明轉氨酶是氨基酸代謝的關鍵酶。

4 結 論

‘玉金香’甜瓜果皮和果肉中共檢測到15 種游離氨基酸和10 種氨基酸代謝酯類香氣物質，采后BTH處理可降低樣品氨基酸含量，抑制氨基酸代謝酯類香氣物質釋放，推遲其釋放高峰；抑制GPT、GOT、PDC和PDH活力，按酶活力峰值高低，被抑制程度排序為：GOT＞PDH＞PDC＞GPT；氨基酸總含量、GOT活力與酯類香氣物質含量呈極顯著正相關（P＜0.01），BTH處理會提高PDH活力與酯類香氣物質含量相關性，減弱PDC活力與酯類香氣物質含量的相關性以及氨基酸總含量與GPT、PDC活力的相關性。可見采后BTH處理可通過降低‘玉金香’果實氨基酸總含量，抑制相關酶GOT、PDC和PDH的活力，改變酯類香氣物質氨基酸代謝各因子間的相關性，從而影響以氨基酸為前體的酯類香氣物質代謝，水處理對氨基酸含量、相關代謝酶活力及其產物酯類香氣物質釋放均有影響，但其作用規律和機理還有待進一步研究。