限制性酶解—鈣融合制備高鈣豆粉的工藝研究

尋崇榮，范志軍，王冬梅，王中江，江連洲，李 楊

(1東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030；2黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司，哈爾濱 150036)

豆乳粉中含有豐富的蛋白質、氨基酸、脂肪酸等營養物質及大豆低聚糖、大豆異黃酮、大豆卵磷脂等功能性成分，易于人體消化吸收，深受消費者的喜愛。目前，制備豆乳粉最常用的是傳統濕法工藝[1]。但傳統工藝技術制得的豆乳粉含鈣量較低，鈣離子的吸收利用低，不利于豆乳粉在國內外的市場推廣[2]。

研究表明，酶解大豆蛋白可提高與鈣離子的結合能力，小分子肽、氨基酸等與鈣鰲合，形成可溶性鰲合物，阻止小腸內鈣的沉淀，以促進鈣的吸收利用[3]。大豆蛋白水解物對碳酸鈣晶體生長有抑制作用，其抑制作用與大豆肽結構有關，且大豆肽分布到碳酸鈣粒子表面會使粒子通過親水作用均勻分散在溶液中提高鈣分散性[3-4]。許慧等[5]利用堿性蛋白酶水解大豆蛋白改善對磷酸鈣的融合性，但需對蛋白水解物進行脫苦處理。包小蘭等[6]對大豆蛋白酶解物進行脫酰胺化處理，結果發現，脫酰胺化作用可增加大豆蛋白水解物的鈣融合量，抑制胃蛋白酶消化作用。張美玲等[7]對大豆分離蛋白的堿性蛋白酶酶解產物進行類蛋白反應修飾，結果發現，大豆分離蛋白酶解聯合類蛋白反應修飾可提高鈣離子螯合能力，但會影響多肽的功能性及口感風味。周小玲[8]對比研究了不同鈣鹽對大豆蛋白聚集的影響，結果發現，離子形式的CaCl2和CaSO4會增大蛋白溶液濁度，而分子形式的Ca3(PO4)2和CaCO3則對大豆蛋白聚集的影響較弱。目前，植物蛋白水解后會產生苦味肽[9]，葛文靜等[10]研究表明，利用木瓜蛋白酶酶解大豆分離蛋白可得到粘度較低、苦味較弱的多肽。風味蛋白酶可有效水解苦味肽，但對完整大豆蛋白的酶解效果較弱，因此可聯合木瓜蛋白酶使用，且木瓜蛋白酶與風味蛋白酶酶解最優參數相似，因此本研究采用木瓜蛋白酶與風味蛋白酶聯合酶解，以降低豆粉苦味[11]。

目前，已有酶解法提高豆乳粉溶解性的研究，然而采用限制性酶解—鈣融合制備高溶解性高鈣豆粉的研究尚未見報道。本文以傳統濕法加工技術制備豆乳粉為基礎，利用限制性酶解及鈣融合技術改善高鈣豆粉的溶解性及鈣吸收效率，為高鈣豆粉的生產加工提供科學支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆，哈爾濱九三油脂集團；大豆磷脂，周口慧洋飼料有限公司；木瓜蛋白酶(酶活力800 U/mg)、風味蛋白酶(20 U/mg)，丹麥novo公司；食品級碳酸鈣，上海圣昆化工有限公司；實驗所需基礎試劑均為分析純，北京化學試劑公司。

1.2 儀器

FDM-Z80豆漿機，上海偉業儀器廠；Ultra-Turrax T25高速分散器，德國IKA公司；噴霧干燥機，無錫昂益達機；AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；pHS-25型酸度計，上海江儀儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，余姚市東方電工儀器廠；XW-80A旋渦混合器，上海青浦滬西儀器廠；HYP-Ⅱ八孔消化爐，上海纖檢儀器有限公司；LNK-871型凱氏定氮快速自動蒸餾器，江蘇省宜興市科教儀器研究所。

1.3 豆乳粉的制備

大豆→浸泡→熱燙→磨漿→漿渣混合物→漿渣分離→豆乳→酶解→滅酶→鈣融合→均質→調配→濃縮→噴霧干燥→豆乳粉。

參照齊寶坤等[1]的方法稱取50 g大豆于燒杯中，用濃度為0.5%的NaHCO3水溶液浸泡10 h左右后用沸水熱燙5 min，按豆水比1∶7的比例添加pH為6.5～7.0的90℃弱堿水進行磨漿得漿渣混合物，然后漿渣分離得豆乳，調節豆乳溫度55℃和pH 7.0，加入一定量木瓜蛋白酶與風味蛋白酶進行酶解，酶解后95℃滅酶5 min，向酶解后的豆乳中加入0.6%的食用級碳酸鈣(占豆乳固形物含量的百分比)，一定壓力下均質處理，添加1.5%的大豆磷脂進行調配混勻，將調配好的豆乳進行真空濃縮至豆乳固形物含量達15%左右，然后在進口溫度為180℃、出口溫度為80℃條件下進行噴霧干燥即得高鈣豆乳粉。

1.4 限制性酶解工藝的單因素確定試驗

保持均質壓力為25 MPa、均質時間為8 min，在其他條件不變的情況下，分別選取酶解時間為0.5、1、1.5、2、2.5h，酶添加量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%(豆乳質量的百分比)，木瓜蛋白酶與風味蛋白酶的質量添加比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5進行單因素試驗。確定酶解工藝對蛋白質分散指數(%)和可溶性鈣結合量(mg/g)的影響。

1.5 鈣融合工藝的單因素確定試驗

保持酶解時間為1.5 h、酶添加量為1.5%、木瓜蛋白酶與風味蛋白酶的質量添加比為1∶4，在其他條件不變的情況下，選取均質壓力為10、15、20、25、30 MPa，均質時間為2、5、8、11、14 min進行單因素試驗。確定鈣融合工藝對蛋白質分散指數(%)和可溶性鈣結合量(mg/g)的影響。

1.6 固形物含量的測定

豆乳中固形物含量按照商業標準SB/T 10633-2011進行測定。

1.7 蛋白質分散指數的測定

參照齊寶坤等[1]的方法取一定量豆乳粉樣品以1∶20的料液比分散于去離子水中，充分攪拌30 min，待分層后將溶解液于3 000 r/min下離心10 min，離心后取上清液測定蛋白含量(凱氏定氮法)。蛋白質分散指數的計算公式如式(1)：

(1)

1.8 可溶性鈣結合量的測定

參照包小蘭[6]的方法，稱取0.01 g豆粉樣品溶于3 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中(pH 7.4)，離心0.5h(6 000 r/min離心)，收集上清液至透析袋(MWCO∶500 Da)中，然后將透析袋移到Tris-HCl(pH7.4)緩沖液中，用保鮮膜密封，用磁力攪拌器在冰箱中(4℃)流動透析，透析結束后，將透析液移到25 mL容量瓶中并定容，通過空氣—乙炔火焰原子吸收光譜法測定鈣含量(參數與包小蘭[6]的設置一致)，即為可溶性結合鈣質量，計算公式如式(2)：

(2)

1.9 數據處理

每組試驗都進行3次平行試驗，并將試驗數據進行誤差分析。采用統計學軟件SPSS 18對試驗數據進行方差分析、相關性和差異顯著性分析；采用Origin 8.5軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 酶解工藝對豆粉蛋白質分散指數和可溶性鈣結含量的影響

2.1.1復合酶質量添加比對蛋白質分散指數和可溶性鈣結合量的影響 蛋白質分散指數可表征豆粉的溶解性，其值越高，豆粉的溶解性越好[1]；可溶性鈣結合量可表征豆粉中鈣離子的人體吸收效率，其值越高，人體對鈣離子的吸收效果越好[12，19]。由圖1可知，酶解可顯著提高豆粉的蛋白質分散指數及可溶性鈣結合量[14-15]，但木瓜蛋白酶與風味蛋白酶的質量添加比對蛋白質分散指數的影響不顯著(P>0.05)，這兩種酶的質量添加比從1∶1增加到1∶2時，可溶性鈣結合量隨這兩種酶質量添加比的增加而顯著提高(P<0.05)，而繼續增加這兩種酶的質量添加比，鈣結合量變化不顯著(P>0.05)，且比值超過1∶3時，鈣結合量有下降趨勢。推測木瓜蛋白酶對豆粉蛋白質分散指數及可溶性鈣結合量的效果高于風味蛋白酶，但風味蛋白酶對鈣結合量有一定促進作用。原因可能是木瓜蛋白酶對豆粉蛋白的酶解較充分，產生大量多肽，風味蛋白酶繼續酶解產生的多肽，形成更多的小分子肽，促進與鈣離子的結合，增加了鈣結合量[6，13]，但風味蛋白酶相對添加過多，導致部分多肽進一步水解成分子量小于8 KDa的小分子肽，減少多肽與鈣離子的結合位點，導致豆粉的鈣結合量降低[13，18]。

圖1 復合酶質量添加比對蛋白質分散 指數和可溶性鈣結合量的影響

2.1.2酶解時間對蛋白質分散指數及可溶性鈣結合量的影響 由圖2可知，當酶解時間從0.5 h增加到1.5 h時，豆粉蛋白質分散指數和鈣結合量隨酶解時間的延長而顯著增加(P<0.05)，酶解時間超過1.5 h后，蛋白質分散指數及鈣結合量有下降趨勢，但兩者變化均不顯著(P>0.05)，說明適當增加酶解時間可改善豆粉的溶解性及鈣結合量[18]。原因可能是酶解初期，底物相對含量較高，酶促反應效率較快，豆乳中大分子蛋白逐漸降解為小分子肽，蛋白乳化性增加，繼而增加與鈣離子的結合量[18]及蛋白質分散指數[16]；但隨著酶解時間的繼續延長，風味蛋白酶不斷降解大豆蛋白肽為小分子肽及氨基酸，導致小分子肽增多，不易吸附于油水界面，多肽乳化性降低，繼而降低豆粉的蛋白質分散指數，且多肽分子量過小會減少鈣離子結合位點，導致鈣結合量有降低趨勢[18]。這與Bao等[18]的研究結果一致，即部分水解可使大豆球蛋白的緊密結構松弛，增加鈣結合位點，但過度水解會降低結合位點，降低鈣結合能力。

圖2 酶解時間對蛋白質分散指數及 可溶性鈣結合量的影響

2.1.3酶添加量對蛋白質分散指數及可溶性鈣結合量的影響 由圖3可知，當酶添加量從0.5%升高到1.5%時，豆粉蛋白質分散指數和可溶性鈣結合量隨著酶添加量的增加而顯著增加，當加酶量達到1.5%后，繼續增加酶添加量，蛋白質分散指數和鈣結合量變化不顯著，說明適當增加酶添加量可提高豆粉的溶解性及鈣結合量。原因可能是相對底物含量的限制及酶分子之間相互碰撞減少了底物與酶碰撞機會，降低酶促效應效率，抑制蛋白質分散指數和鈣結合量的增加，這與徐錦麗[17]及包小蘭[6]的研究結果一致，即適度增加酶添加量可改善大豆蛋白的溶解性及可溶性鈣結合量。

圖3 酶添加量對蛋白質分散指數 及可溶性鈣結合量的影響

2.2 鈣融合工藝對豆粉蛋白質分散指數和可溶性鈣結含量的影響

圖4 均質壓力對蛋白質分散指數及 可溶性鈣結合量的影響

2.2.1均質壓力對蛋白質分散指數和可溶性鈣結合量的影響 由圖4可知，豆粉蛋白質分散指數隨著均質壓力的增加而顯著增加(P<0.05)；當均質壓力從10 MPa升高到25 MPa時，可溶性鈣結合量隨均質壓力的增加而顯著增加(P<0.05)，均質壓力達到25 MPa后，繼續增加壓力，豆粉中鈣結合量無顯著變化(P>0.05)，說明提高均質壓力，可在一定程度上改善豆粉的溶解性、提高鈣結合量。原因可能是在的高速分散作用下大豆多肽與大豆磷脂及鈣離子充分接觸，促進多肽與磷脂及多肽與鈣離子的相互作用，提高多肽的乳化性及鈣融合性，且將豆乳分散為更小的乳液滴，以致豆粉蛋白質分散指數及鈣結合量提高[14]。壓力增大，可提高分散效果[14]，在均質壓力大于25 MPa時，繼續增加壓力鈣結合量變化不明顯，原因可能是達到鈣結合位點上限。綜合考慮加工成本，選擇均質壓力為25 MPa。

2.2.2均質時間對蛋白質分散指數和可溶性鈣結合量的影響 由圖5可知，均質初期，隨著均質時間的延長，豆粉蛋白質分散指數及鈣結合量顯著增加(P<0.05)，均質時間超過8 min后，豆粉蛋白分散指數無顯著變化，11 min后，鈣結合量變化不大。說明適當增加均質時間可改善豆粉的溶解性與鈣結合量。綜合考慮蛋白質分散指數、鈣結合量的變化及加工成本，選擇均質時間為8 min。

圖5 均質次數對蛋白質分散指數和豆乳表觀粘度的影響

3 結論

本文對限制性酶解—鈣融合制備高鈣豆粉工藝進行研究，分別采用離心法及原子吸收光譜法測定豆粉的蛋白質分散指數和可溶性鈣結合量。單因素試驗表明，酶解時間、酶添加量、均質壓力、均質時間對豆粉蛋白質分散指數及可溶性鈣結合量具有顯著影響。酶解可顯著提高豆粉的蛋白質分散指數及可溶性鈣結合量，但木瓜蛋白酶與風味蛋白酶的質量添加比對蛋白質分散指數的影響不顯著；適當增加酶解時間、酶添加量，適當提高均質壓力及均質時間，可在一定程度上改善豆粉的溶解性、提高鈣結合量。◇