益腎安宮方治療復發性流產療效及對患者外周血T細胞亞群和細胞因子表達水平的影響

陳瑞紅，劉 琰，劉玉玲△

1.鄭州大學第二附屬醫院(鄭州 450003 )，2.鄭州大學第三附屬醫院(鄭州 450052 )

主題詞 流產/中西醫結合療法 補腎劑/治療方法 @益腎安宮方 療效比較研究

復發性流產(RSA)主要指連續發生不小于2次的自然流產，是一種婦產科常見疾病，病因較為復雜，涉及內分泌、遺傳、生殖道感染等方面，大部分原因不明[1-2]。相關研究表明，妊娠婦女體內會發生十分復雜的免疫調節過程，妊娠結局與外周血T細胞亞群分化失衡密切相關[3-4]，其中Th1/Th2細胞失衡學說最經典，近年來發現Th17/Treg這對免疫細胞同樣會影響患者的妊娠結局。目前,臨床上對RSA患者的常規治療為黃體酮注射液，具有一定的保胎作用，但臨床療效不高。中醫學認為，RSA屬于“滑胎”范疇，主要特點為胚胎應期而下、且會反復發作，治療的關鍵是補腎固胎[5]。益腎安宮方為一種中藥制劑，具有益腎養陰、固胎防滑之功效[6]，但目前對于益腎安宮方用于治療RSA患者的相關研究甚少。為此，本研究將探討益腎安宮方用于治療RSA患者的療效及其對外周血T細胞亞群的比例和細胞因子表達水平的影響。

資料與方法

1 一般資料 選取2015年1月至2016年12月我院收治的89例RSA非孕期患者為研究對象，按照隨機數表法分為治療組和對照組，本研究已經我院倫理委員會審核并批準。治療組：患者44例，年齡23～42歲，平均年齡(28.17±4.98)歲；平均體重(57.95±8.93)kg；在中醫證型上屬于腎虛血熱型24例，脾腎兩虛型20例。對照組：患者45例，年齡21～43歲，平均年齡(28.31±5.02)歲；平均體重(57.89±8.97)kg；腎虛血熱型23例，脾腎兩虛型22例。納入標準：均符合RSA相關的診斷標準[7]的婦女；均有連續兩次或以上的自然流產史，且末次流產發生時間不超過1年；內分泌正常，且對本研究知情同意者。排除標準：生殖道感染或畸形；患有重要臟器疾病或自身免疫病等；夫婦外周血染色體核型異常。兩組研究對象的年齡、體重和中醫證型上等均無統計學差異(均P>0.05)，有可比性。

2 治療方法 其中對照組肌肉注射黃體酮20mg(國藥準字：H33020828)進行治療，1次/d，1周為1個療程，持續治療3周。治療組在上述基礎上給予益腎安宮方進行治療，若患者為腎虛血熱型，則給予益腎安宮I號方保陰煎加減，組方為：熟地黃、黃芩、生地黃、山藥、炒白芍、桑寄生和鹽續斷各15 g，阿膠和墨旱蓮各12 g，甘草5 g。若患者為脾腎兩虛型，則給予益腎安宮II號方壽胎丸四君子湯加減，組方為：菟絲子30 g，熟地黃、炒黨參、炒白芍、杜仲、桑寄生和鹽續斷各15 g，炒白術、阿膠和茯苓各12 g，甘草5 g。兩種組方均為加300 ml清水煮沸，取藥汁服用，1劑/d，每日分3次服用，1周為1個療程，持續治療3周。

3 療效評價標準 對兩組患者治療后的妊娠結局進行隨訪記錄，將宮內妊娠大于12周歸為妊娠成功，分娩嬰兒存活則為活產。采集兩組患者治療前、治療3周后靜脈血各2管，其中1管為5 ml不抗凝，離心后取上清液，通過ELISA法對血清中細胞因子IFN-γ、IL-17、TGF-β和IL-4水平進行檢測，試劑盒來自美國Adlitteram Diagnostic Laboratories公司；另1管為8 ml放肝素抗凝管中，根據達科為公司給出的有關淋巴細胞分裂液操作說明書將外周血單個核細胞(PBMC)進行收集，加入乙酸肉豆蔻佛波醇、莫能霉素及離子霉素(均購自Gibco公司)進行刺激作用，5 h后收集細胞，對細胞表面CD4+分子、胞內IL-17、IFN-γ、IL-4和相應同型對照抗體進行染色作用，通過FACSCalibur流式細胞對Th1、Th17、Th2和Treg細胞比較進行檢測；利用qRT-PCR技術檢測T-bet、STAT-3、GATA-3、RORγt和FOXP3mRNA表達水平。所有操作均嚴格按照說明書進行。

結 果

1 兩組患者治療后妊娠結局比較 隨訪1年期間，治療組35例妊娠成功，妊娠成功率為79.55%(35/44)，其中30例活產，活產率為85.71%(30/35)。對照組27例妊娠成功，妊娠成功率為60%(27/45)，其中17例活產，活產率為62.96%(17/27)。治療組的妊娠成功率和活產率均明顯大于對照組(χ2=4.022，4.302，均P<0.05)。

2 兩組治療前后T細胞亞群比例情況 治療前兩組Th1、Th2、Th17和Treg細胞比例相比均無明顯差異(均P>0.05)。經治療，治療組Th1和Th17細胞比例均明顯低于對照組，Th2和Treg細胞比例均明顯高于對照組(均P<0.05)，見表1。

3 兩組治療前后血清各細胞因子水平比較 治療前兩組IFN-γ、IL-4、IL-17和Treg水平相比均無明顯差異(均P>0.05)。治療后，治療組IFN-γ和IL-17水平均明顯低于對照組，IL-4和TGF-β水平均明顯高于對照組(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組治療前后血清各細胞因子水平比較

4 兩組各項其他指標比較 治療前兩組T-bet、GATA-3、STAT-3、FOXP3和RORγt mRNA表達水平相比均無明顯差異(均P>0.05)。經治療，治療組T-bet、STAT-3和RORγt mRNA表達水平均明顯低于對照組，GATA-3和FOXP3 mRNA表達水平均明顯高于對照組(均P<0.05)，見表3。

表3 兩組治療前后T-bet、GATA-3、STAT-3、FOXP3和RORγt mRNA表達水平比較(×103)

討 論

中醫學將RSA歸為“滑胎”，認為腎為胎元穩固之本，腎虛、沖任不固容易引發滑胎，所以治療應以補腎固胎、養陰清熱為主[8]。通過補腎來防止滑胎的治療方式最早出自宋代《女科百問》。馮曉玲等[9]研究也表明，采用補腎活血法治療Th1/Th2失衡的不明原因RSA患者可以有效提高治療有效率。益腎安宮方是一種中藥制劑，具有健脾養陰、益腎固胎的功效，應用于治療不明原因RSA和先兆流產患者均已取得良好的臨床效果[10]。本研究結果顯示，治療后隨訪1年期間治療組的妊娠成功率和活產率均明顯大于對照組，可見益腎安宮方治療RSA患者可以有效改善其妊娠結果。針對腎虛血熱型患者，益腎安宮I號方中的熟地黃、生地黃和黃芩可清熱涼血、養陰安胎；山藥和墨旱蓮可健脾養胃、滋補肝腎；白芍和阿膠可補血斂陰；桑寄生和續斷可補腎固沖；加甘草以調和諸藥。全方溫而不燥，共奏補腎養血、清熱涼血、安胎固沖的功效。針對脾腎兩虛型患者，益腎安宮II號方以菟絲子作為君藥，該藥味甘性平、善吸收他物之氣以自養，具有益陰固陽、補腎壯筋的作用；組方中的黨參、白術和茯苓可健脾益氣；白芍和阿膠可補血斂陰；桑寄生和杜仲可補腎固沖；加甘草以調和諸藥，共奏補腎健脾、氣血調和、安胎固沖的功效。張偉等[11]研究也表明，益腎安宮方具有補腎健脾的功效，可改善胎盤功能，增加保胎有效率，臨床療效顯著。

相關研究表明[12]，RSA患者的妊娠結局和T細胞亞群(Th1、Th2、Th17等)的分化失衡密切相關。其中Th1細胞主要分泌IFN-γ等細胞因子，其特異性轉錄因子為T-bet(T-box家族成員)，可誘導產生IFN-γ；Th2細胞主要分泌IL-4等細胞因子，其特異性轉錄因子為GATA-3(一種鋅指蛋白)，可誘導IL-4的產生。轉錄因子對Th細胞極性分化具有非常重要的調控作用，其中T-bet對Th1細胞的發育具有促進作用，還會抑制IL-4的分泌，GATA-3則對Th2細胞的發育具有促進作用，兩者可相互抑制。Th17細胞具有較強的促炎癥作用，主要分泌IL-17等細胞因子，其特異性轉錄因子為STAT-3和RORγt；Treg細胞的特異性轉錄因子為FOXP3。Treg細胞與Th17細胞存在密切聯系，其中TGF-β和IL-6是兩者連接的關鍵：TGF-β含量較高時可將初始T細胞活化分化成Treg細胞；少量的TGF-β和IL-6又可將活化的初始T細胞表達RORγt進而分化成Th17細胞[13]。本研究結果顯示，經治療后，治療組Th1和Th17細胞比例均明顯低于對照組，Th2和Treg細胞比例均明顯高于對照組，表明益腎安宮方治療RSA患者可有效調節T細胞亞群分化失衡狀態。且經治療后，治療組IFN-γ和IL-17水平均明顯低于對照組，IL-4和TGF-β水平均明顯高于對照組。可見益腎安宮方能夠改善相應的細胞因子水平。通過檢測患者T細胞相應的轉錄因子的表達水平，結果發現治療后，治療組T-bet、STAT-3和RORγt mRNA表達水平均明顯低于對照組，GATA-3和FOXP3 mRNA表達水平均明顯高于對照組。這進一步證實了益腎安宮方能夠有效調節患者T細胞亞群分化失衡狀態，這可能與益腎安宮方具有健脾養陰、調節氣血、益腎固胎的功效有關[14]。

綜上所述，益腎安宮方治療RSA患者可以有效改善其妊娠結果，調節T細胞亞群分化失衡狀態，并有效改善相應的細胞因子水平及轉錄因子的表達水平。