IGF-1對6-OHDA誘導神經元氧化損傷的保護作用

董曉光，許孝飛，馬江波，瞿寶明，扈燕來，張靜，李濤△

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）臨床上主要表現為靜止性震顫、運動遲緩，其主要的病理改變為中腦黑質多巴胺能神經元進行性變性導致多巴胺（Dopamine，DA）含量降低以及Lewy小體的形成［1］。雖然目前PD的確切發病機制還不完全清楚，但有研究表明，引起PD的多種致病因素均可通過氧化應激這一共同通路造成神經元的損傷［2-3］。因此，減輕多巴胺能神經元氧化應激成為防治PD的一個重要策略［4］。

PC12細胞源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，胞質內富含多巴胺受體以及合成、分解DA所需的各種酶，能合成、儲存并釋放DA，具有典型的神經細胞特征，被廣泛應用于DA能神經元的研究［5］。6-羥基多巴胺（6-OHDA）是DA能神經遞質的羥基化衍生物，結構與DA相似。6-OHDA與DA競爭攝取位點后進入細胞內，通過自身及產生的活性氧（ROS）對黑質多巴胺能神經元產生氧化應激損傷作用，導致多巴胺能神經元死亡［6］，已被廣泛應用于PD動物和細胞模型中。近年來研究發現，胰島素樣生長因子-1（IGF-1）具有抗氧化損傷及細胞凋亡的作用，在多種細胞培養體系中加入一定濃度的IGF-1可以起到抗氧化損傷作用［7-8］。但是，IGF-1對6-OHDA處理PC12細胞引起的細胞損傷的保護作用尚不明確。本研究以6-OHDA處理PC12細胞建立PD模型，探討IGF-1對6-OHDA誘導的神經元氧化損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料PC12細胞系購自中國科學院上海細胞庫；6-OHDA購自于美國Sigma公司；IGF-1購自PeproTech公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）購自Biosharp；ROS試劑盒購自碧云天生物工程有限公司；Hoechst33342、PI購自Gibco公司；DMEM高糖培養基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）等均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及實驗濃度篩查 將處于對數生長期的PC12細胞置于含10%FBS的高糖DMEM培養液中，于37℃、5%CO2培養箱中培養，隔日更換培養基。將PC12細胞分為實驗組和對照組，實驗組分為5個亞組，分別加入25、50、100、150、200 μmol/L的6-OHDA（溶解于維生素C溶液），對照組加入等體積維生素C溶液。將各組細胞繼續培養24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況。

1.2.2 MTT法檢測細胞活性PC12細胞的單細胞懸液以1×104個/孔的密度接種于96孔培養板中，給予25、50、100、150、200 μmol/L 6-OHDA處理后，分別于處理后12、24和48 h加入終濃度為0.5 mg/L的MTT，37℃下繼續孵育4 h后，小心吸棄孔內上清液。每孔內加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），室溫下振蕩10 min以終止反應并充分溶解甲臜結晶，Bio-Rad酶標儀測定492 nm處的光密度（OD）值，每組重復3次。

1.2.3 IGF-1處理分組及活性檢測 綜合以上實驗結果，選取150 μmol/L的6-OHDA濃度作為本實驗的處理濃度及處理后24 h作為檢測時間點。分為（1）對照組：加入等體積維生素C溶液。（2）6-OHDA組：給予150 μmol/L的6-OHDA處理。（3）IGF-1+6-OHDA組：給予IGF-1 100 nmol/L預處理2 h，然后加入150 μmol/L 6-OHDA。將各組細胞繼續培養24 h后，MTT法檢測細胞活性。方法同1.2.2。

1.2.4 ROS水平檢測 各組PC12細胞以6×105/mL的濃度接種于24孔板，24 h后棄培養基，加入200 μL終濃度為10 μmol/L的無血清2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸酯（DCFH-DA），于細胞培養箱內37℃孵育20 min，棄染液，用無血清培養基洗3遍，加入500 μL培養基，在倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，Image J軟件分析熒光強度。

1.2.5 Hoechst33342/PI雙染法檢測細胞凋亡 各組PC12細胞以6×105/mL的密度接種于24孔板內，孵育24 h后吸棄培養基，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗細胞2次，24孔板中加入200 μL終濃度為10 mg/L的Hoechst33342和PI混合工作液，37℃染色15 min，棄染液，PBS洗1遍后，倒置熒光顯微鏡下觀察并照相分析。每組隨機取5個視野，應用IPP圖像分析軟件分別計數每張圖片中PC12細胞的總數目及凋亡細胞數目，計算PC12細胞凋亡率（細胞凋亡率=凋亡細胞數/PC12細胞總數目×100%）。每組重復3次。

1.3 統計學分析 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間均數比較應用獨立樣本t檢驗，多組間比較應用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 6-OHDA對PC12細胞的損傷作用 光學顯微鏡下可見對照組PC12細胞均勻分布，胞體呈圓形或橢圓形，形態規則，突起長短不一并相互連接形成網狀結構。給予不同濃度的6-OHDA處理后，PC12細胞數量逐漸減少，胞體萎縮，突起變短、斷裂甚至消失，網狀結構斷裂，且這種損傷呈濃度依賴性。選取不同時間點進行檢測，MTT結果顯示，與對照組相比，6-OHDA處理12 h后，各實驗亞組PC12細胞活力變化不明顯；24 h后細胞活性開始下降，并隨6-OHDA濃度的增加，細胞活性逐漸降低，呈濃度依賴性；48 h后，即使較低濃度的6-OHDA處理，細胞活力也較對照組下降明顯，見圖1。綜合以上實驗結果，150 μmol/L 6-OHDA處理24 h后細胞損傷明顯，以此作為本研究的最佳的實驗濃度和觀察時間，進行后續實驗。

2.2 各組PC12細胞活性檢測結果 結果顯示，與對照組相比，6-OHDA組細胞活性明顯下降，IGF-1+6-OHDA組細胞活性則高于6-OHDA組，IGF-1表現出較為顯著的細胞保護作用，見圖2。

2.3 PC12細胞內ROS檢測結果 結果顯示，與對照組相比，6-OHDA組PC12細胞綠色熒光強度明顯增加，表明6-OHDA誘導PC12細胞產生了大量ROS。而給予IGF-1預處理后，IGF-1+6-OHDA組PC12細胞綠色熒光強度較6-OHDA組顯著減弱，綠色熒光變暗，見圖3A。6-OHDA組綠色熒光強度是對照組的（2.29±0.20）倍，而IGF-1+6-OHDA組熒光強度降低為對照組的（1.31±0.13）倍，見圖3B。

Fig.1 Effects of different concentrations of 6-OHDA on the activity of PC12 cells at different time points圖1 不同濃度6-OHDA處理后不同時間點對PC12細胞活性的影響

Fig.2 Effects of IGF-1 on the activity of PC12 cells treated with 6-OHDA圖2 IGF-1對6-OHDA處理的PC12細胞活性的影響

Fig.3 Detection results and analysis of ROS of PC12 cells圖3 PC12細胞內ROS檢測結果

2.4PC12細胞凋亡結果 經Hoechst33342/PI染色后，對照組PC12細胞胞核呈淡藍色圓形或橢圓形，染色體均勻一致；6-OHDA組PC12細胞核縮小、亮藍色的凋亡細胞及紅色死亡細胞明顯增多，見圖4A；而給予100 nmol/L IGF-1預處理2 h，再次給予相同濃度的6-OHDA處理后，PC12細胞的凋亡細胞及死亡細胞明顯減少，見圖4B。

Fig.4 Results and analysis of apoptosis of PC12 cells圖4 PC12細胞凋亡結果

3 討論

3.1 PD與氧化應激PD作為全球第二大神經退行性疾病，以中腦黑質多巴胺能神經元變性及紋狀體內多巴胺遞質丟失為病理特征，其確切的發病機制尚不明確，目前認為PD主要是基因易感性和環境因素雙重作用的結果［9］，而年齡、氧化應激、線粒體功能障礙、蛋白質代謝紊亂和細胞凋亡都與PD的發病密切相關［10-11］。研究表明，DA合成過程中產生的ROS、低水平的谷胱甘肽以及鐵離子濃度的升高均是導致PD患者黑質和紋狀體通路神經元死亡的重要因素［12］。另外，DA代謝中產生的醌、過氧化物和其他的ROS也會促進細胞的氧化應激損傷。在PD患者腦中的黑質致密部發現有大量的ROS產生，這也提示了氧化應激反應在PD的損傷中扮演重要的角色［13］。然而目前臨床尚無有效的抗氧化應激藥物，減輕氧化應激所致的多巴胺能神經元損傷成為治療PD的研究熱點。

3.2 6-OHDA對PC12細胞的氧化應激損傷 氧化應激是指ROS的產生超過了細胞抗氧化能力的狀態，可由多種因素引發，被認為是PD發病的核心環節之一［14］。氧自由基可以導致細胞膜脂質過氧化作用和蛋白質氧化，從而破壞細胞的完整性，誘發細胞凋亡。內源性抗氧化酶系統，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等功能異常，導致過量ROS產生，引起脂質過氧化產生丙二醛（MDA）、蛋白羰基化和DNA斷裂［15］。6-OHDA通過介導細胞內外的氧化反應產生ROS等物質，直接抑制線粒體呼吸鏈，誘發氧化應激反應，從而損傷中樞多巴胺能神經元，導致黑質-紋狀體通路發生退行性變。ROS作為氧化應激的產物，首先出現在線粒體中，當ROS大量累積時可氧化重要的細胞結構，如脂質、蛋白質和DNA，通過線粒體途徑引起細胞凋亡，導致PD的發生發展［16］。因此，抑制ROS對阻斷PD的發生發展有重要意義。本研究中發現，6-OHDA能夠誘導PC12細胞內產生過量ROS，提示在6-OHDA作用下，PC12細胞處于氧化應激狀態。細胞活性檢測顯示，隨著6-OHDA濃度的增加，PC12細胞活性下降，呈濃度依賴性，細胞凋亡數量也明顯增多，PC12細胞損傷嚴重。

3.3 IGF-1對PC12細胞的保護作用IGF-1主要在肝臟合成，是由70個氨基酸組成的分子質量為7 649 ku的多肽，具有內分泌、自分泌和旁分泌三種特性，與其受體（IGF-1R）結合從而發揮生物學功能，并參與機體多種器官功能調節［17］。研究表明，IGF-1不僅具有胰島素類似的功能及介導生長激素的作用，還能通過抑制半胱天冬酶-3（Caspase-3）、Caspase-9等而發揮抗凋亡作用，抑制神經元、神經膠質細胞及肌肉細胞的凋亡［18］。其在線粒體保護、神經保護、改善胰島素抵抗和脂質代謝以及抗氧化作用等方面具有許多優點。IGF-1對多巴胺能神經元尤其重要，大腦黑質中IGF-1 mRNA的濃度比大腦其他部位的總濃度高3倍，并且黑質中酪氨酸羥化酶免疫陽性細胞中包含IGF-1受體［19］。Ayadi等［20］在6-OHDA紋狀體灌注大鼠PD模型研究中發現，IGF-1可以通過Ras/ERK1/2和PI3K/AKT信號轉導通路發揮抗氧化應激、保護多巴胺能神經元的作用。IGF-1屬于腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF），與其他大多數的BDNF不同的是，IGF-1能夠通過轉運系統穿過血腦屏障。已有研究證明，血液中的IGF-1在腦損傷［21］、脊髓損傷［22］和海馬神經生成［23］中發揮重要的保護作用，這種特性對神經退行性疾病的治療干預具有明顯優勢。因此，筆者用外源性IGF-1預處理，觀察對6-OHDA介導的PC12細胞的毒性損傷的保護作用，具有重要的臨床應用價值。本研究中發現，給予100 nmol/L的IGF-1預處理后，與6-OHDA組比較，IGF-1+6-OHDA組PC12細胞活力下降減少、ROS水平下降、細胞凋亡減少，表現出很好的神經保護作用。

綜上所述，一定濃度的IGF-1能夠減少6-OHDA引起的PC12細胞氧化損傷及凋亡，增加細胞活性，為防治PD的發生發展提供了潛在的策略，但其確切機制還有待于進一步的研究。