實時無標記細胞分析系統與臺盼藍染色法分析雙酚A對小鼠睪丸間質細胞毒性作用的比較

馬 林，羅家權，李 丹，張 康，張玉敏，裴秀叢，段志文，馬明月

0 引言

雙酚A(Bisphenol A，BPA)是一種環境內分泌干擾物，其作為增塑劑廣泛應用于水瓶、塑料袋、食品包裝袋等生活用品中。據統計，每年BPA的產量在390萬噸左右[1]。研究顯示，BPA存在于水體、土壤、空氣及生物體內[2]。由于BPA的化學結構與雌激素類似，也被稱為類雌激素樣物質，因此，BPA對動物胚胎發育、生殖系統的損傷作用被廣泛關注。

實時無標記細胞狀態分析系統(Real-time cell analysis,RTCA)是一種通過專用接種板下微金電子傳感器芯片，當貼壁生長在微電極表面的細胞引起電極界面阻抗的改變時，該阻抗值的變化直接反映細胞的生物學狀態。因此，RTCA在細胞生理狀態下可以實時、連續、定量跟蹤細胞形態和增殖分化改變，為細胞水平的分析研究提供了一個實時動態信息獲取的獨特方法[3-4]。本文結合RTCA iCELLigence系統與臺盼藍染色法對BPA引起的小鼠睪丸間質細胞(TM3)的細胞毒性進行監測，通過對比研究細胞毒性的最佳實驗手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 小鼠睪丸間質細胞(TM3)購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 儀器和試劑 CO2培養箱(美國Thermo公司)、超凈工作臺(中國東聯哈爾儀器制造有限公司)、倒置顯微鏡(中國北京新惠澤奧科技有限公司)、臺式離心機(美國Thermo公司)、RTCA iCELLigence(中國艾森生物有限公司)、Vi-cell細胞活力計數儀(美國貝克曼庫爾克有限公司)。BPA(純度：99%，美國Sigma公司)；DMEM-F12培養液(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Biochrom)；青霉素-鏈霉素(美國Biological Iudustries公司)；二甲基亞砜(DMSO,美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠TM3細胞培養 TM3細胞培養于10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM-F12培養基中，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，待細胞鋪滿T25瓶底80%左右進行傳代，傳至第3代后開展后續實驗。

1.2.2 臺盼藍法測定細胞毒性 當細胞死亡時，由于細胞膜結構發生破損，可透過臺盼藍染料。死亡或失去活力的細胞因為著色，其色調比正常細胞暗淡。Vi-cell細胞活力分析儀通過對該色調明暗進行拍照對比進行活力的檢測，以此判斷受試物的細胞毒性。應用Vi-cell對細胞進行計數，將8×104/ml的細胞接種于16孔板中，每孔加液量1 ml，接種24 h后吸去培養基，更換無血清培養基進行同步化處理12 h，加入含不同濃度BPA(0、1、10、100、1 000 μmol/L)的含10%胎牛血清的培養液孵育24 h，進行消化，取1 ml細胞懸液上樣至Vi-cell細胞活力分析儀中，按照儀器操作說明測定細胞活力，并計算相應的半數抑制濃度(IC50)。

1.2.3 RTCA接種密度測試 應用Vi-cell進行細胞計數，分別將0.5×105、1×105、2×105/ml的細胞200 μl接種于專用的E-plate 8孔板上進行接種數量的預實驗。

1.2.4 RTCA法測定細胞毒性 預實驗后的細胞接種于8孔板，正常培養基培養24 h后吸去培養基，換做無血清培養基進行同步化處理12 h，加入含不同濃度BPA(0、1、10、100、1 000 μmol/L)的含10%胎牛血清的培養液孵育24 h。通過RTCA系統各孔微電阻量的變化實時監測TM3細胞生長狀況，通過細胞生長的動力變化反應曲線，觀察BPA對TM3細胞毒性情況，并計算出相應的IC50。

2 結果

2.1 TM3細胞接種密度檢測 將3種不同密度的細胞接種于E-plate 8孔板后培養96 h，細胞生長曲線表明，當接種密度為2×105/ml時，細胞在接種24 h后進入指數增長期，因此，后續實驗采用2×105/ml的接種密度。見圖1。

圖1 小鼠睪丸間質細胞不同接種密度生長曲線

2.2 臺盼藍檢測法檢測BPA對小鼠睪丸間質細胞的細胞毒性 應用Vi-cell細胞活力分析儀檢測各濃度BPA暴露24 h后活性細胞比例。與未加入BPA的DMSO對照組比較，各組活細胞比例出現下降的趨勢，并且在1 000 μmol/L時下降最為明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 臺盼藍檢測法分析BPA對TM3的細胞毒性情況

2.3 臺盼藍染色法分析BPA對TM3的細胞毒性 各BPA暴露組的細胞活力IC50為745 μmol/L，根據濃度的反對數所得的濃度曲線如圖3所示。

2.4 RTCA分析系統實時監測結果 采用RTCA分析系統實時監測細胞生長情況，共監測70 h，結果顯示，無血清同步化處理前細胞呈指數增長的趨勢，同步化處理后細胞增長的速度變慢，提示達到同步化處理的目的。加入BPA后，不同濃度的BPA均能使TM3的細胞活力出現不同程度的下降，其中濃度為1 000 μmol/L時下降最為明顯。見圖4。

2.5 RTCA活力檢測法 RTCA活力檢測法結果表明，BPA對TM3細胞毒性的IC50為704 μmol/L，其濃度曲線及結果如圖5所示。

圖3 反對數變換后的細胞活力隨濃度變化曲線

圖4 RTCA監測BPA對小鼠睪丸間質細胞的細胞毒性作用

圖5 RTCA分析系統計算IC50的細胞指數情況

3 討論

RTCA系統通過專用培養板上的新型傳感芯片設計，可連續監測生物反應的全過程，并且其監測是無標記、無創傷型的數據獲取和分析平臺[5]，其專用的E-Plate板底部鋪滿微金電極，細胞數量及大小的變化影響電阻抗的變化，其變化反應為電阻值的改變，以細胞指數(CI)的形式輸出，能夠定量評估細胞數量、存活率及形態變化等細胞生理狀態指標。基于阻抗動態檢測細胞活力與相應的細胞計數與MTT法得到的結果一致[6]。本實驗通過RTCA法與傳統的臺盼藍染色法分析BPA對小鼠睪丸間質細胞的細胞毒性過程中，在比較兩種方法的同時，也對BPA所導致的細胞毒性情況進行雙重驗證。

環境雌激素BPA在環境中廣泛存在，具有劑量小、潛伏期長和接觸頻繁等特點，是危害較大的一類環境內分泌干擾物[7]。BPA可通過皮膚、呼吸道、消化道等多種途徑進入機體，引起多系統的損傷，如神經系統、代謝系統、免疫系統、生殖系統，并通過基因的改變遺傳給下一代，其對生殖系統的損害已越來越受到人們的重視[8-10]。本研究發現，不同濃度的BPA均使TM3細胞活力出現不同程度的降低，其中以1 000 μmol/L下降最為明顯。兩種方法計算出的IC50均為700 μmol/L左右，其絕對值并不完全相同的原因可能是不同的細胞批次及檢測設備靈敏性的差異，但其范圍與趨勢均相同。從整個實驗過程來看，RTCA能夠實時監測細胞不同時間的生長狀態，從細胞指數曲線上可以直觀看到整個實驗過程TM3的生長情況，在對處理時間的節點選擇上，可以根據細胞的生長情況進行判斷，依據更加充分可靠。因此，RTCA系統較好地彌補了傳統臺盼藍染色法只能看到終點情況的缺點，其結果與周慧等[11]研究的結果相同。通過對兩種方法的比較，我們可以看出，RTCA系統具有更加準確、直觀等特點，是一種細胞生物學研究領域的良好實驗手段。