羅格列酮對慢性阻塞性肺疾病炎癥損傷的保護機制研究

陳麗朱,羅 京

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以氣流受限不可逆為特征的慢性炎癥性肺部疾病[1]。研究顯示，其發(fā)病率高,預(yù)后差,在美國，每年約有10 000人死于COPD,高居美國疾病死亡率第4位[2]。在我國，COPD患病率在40歲以上人群約為9.9%,因此，控制或減少COPD是一個重大的公共健康問題。研究顯示，降糖藥羅格列酮具有抗炎、抑制腫瘤、拮抗凋亡和調(diào)節(jié)免疫等功效[3-4],本研究擬用羅格列酮干預(yù)COPD大鼠,探討羅格列酮對COPD大鼠的保護作用及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和設(shè)備 健康成年雄性SD大鼠30只,體重(220±20)g,購自武漢大學(xué)實驗動物中心。羅格列酮(Sigma,美國);脂多糖(Sigma,美國,1 mg/ml);水合氯醛(武漢谷歌生物)。PI3K(CST，USA)、AKT(CST，USA)、p-AKT(CST，USA)、白細胞介素(IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒(RD,美國);引物(擎科生物),逆轉(zhuǎn)錄儀(Eppendorf),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GeneCopoeia，USA),紫外分光光度計(Thermo fisher,美國),顯微鏡(Olympus BX51,日本)和成像系統(tǒng)(HITMAS-30,日本)。

1.2 實驗動物分組 30只SD大鼠隨機均分為對照組(C組)、模型組(COPD組)和羅格列酮組(RGZ組)。采用煙霧暴露聯(lián)合氣道滴入脂多糖構(gòu)建大鼠COPD模型。RGZ組在煙霧暴露前30 min給予羅格列酮(20 μg/只)灌胃,C組和COPD組給予等量生理鹽水灌胃,共30 d,具體劑量參考文獻[5]。COPD組和RGZ組大鼠每天置于煙室4次,每次1 h,共30 d。從第15天起，RGZ組和COPD組大鼠氣道內(nèi)注入200 μl脂多糖,C組正常飼養(yǎng),具體操作參考文獻[5]。在第30天,利用腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后,行氣管插管,采用AniRes2003動物肺功能呼吸系統(tǒng)測定各組大鼠肺順應(yīng)性(CL)、第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3%)與用力肺活量(FVC)之比和用力呼氣流量(MMEF);此外,用PBS灌洗左側(cè)支氣管肺泡。將BALF離心、重懸,送醫(yī)院檢驗科，利用血細胞分析儀檢測中性粒細胞數(shù)和中性粒細胞之比,并收集右肺和血清,-80 ℃冰箱凍存。

1.3 肺組織病理檢查 取肺組織放置于4%甲醛固定48 h后，石蠟包埋,切片,制片，HE染色觀察肺組織病理形態(tài)。

1.4 ELISA檢測血清中和BALF中炎癥細胞因子表達水平 取各組血清和BALF，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測血清和BALF中IL-6、TNF-α和IL-1β表達水平。

1.5 RT-PCR檢測肺組織炎癥細胞因子mRNA水平 取右肺組織,提取RNA，檢測RNA含量,反轉(zhuǎn)錄,上樣,IL-6、IL-1β和TNF-α引物序列如表1所示,擴增條件為:變性94 ℃ 10 s→退火59 ℃ 45 s→60 ℃ 1 min×35個循環(huán),利用圖像分析儀器進行掃描分析,具體步驟參見文獻[6]。

1.6 Western blot檢測肺組織蛋白表達 取肺組織,提取總蛋白。采用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,按說明書進行Western blot實驗,檢測PI3K、AKT和p-AKT表達、最后采用ECL試劑盒顯影并成像。每組實驗重復(fù)3次,具體步驟參見文獻。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 C組大鼠毛發(fā)白皙,光滑,活動性良好,無咳嗽,飲食良好,體重增加率為81.12%±10.23%,COPD組大鼠毛發(fā)萎黃,大量脫落,活動性差,經(jīng)常出現(xiàn)咳嗽,飲食明顯減少,體重增加率為55.13%±5.12%,一般情況較對照組明顯變差。RGZ組大鼠毛發(fā)少量萎黃和脫落,活動性較差,偶爾出現(xiàn)咳嗽,飲食欠佳,體重增加率為72.46%±6.21%,一般情況優(yōu)于COPD組。

2.2 羅格列酮對各組大鼠肺組織病理形態(tài)的影響 C組肺泡壁完整,肺泡間隔均勻一致,肺泡腔充氣好,無炎癥細胞浸潤。COPD組與C組比較,肺泡間隔明顯增厚,肺泡壁厚度明顯變薄,肺泡腔萎陷,管腔變窄,萎縮肺泡陷明顯增多,可見大量炎癥細胞浸潤。RGZ組與COPD組比較,肺泡間隔大多正常,肺泡腔充氣良好,可見少量萎縮肺泡,炎癥細胞浸潤明顯減少,見圖1。

2.3 羅格列酮對各組大鼠肺功能的影響 與C組比較,COPD組大鼠CL、FEV0.3%/FVC和MMEF均明顯降低(P<0.05);與COPD組比較,RGZ組大鼠CL、FEV0.3%/FVC和MMEF均明顯增高(P<0.05),提示羅格列酮可明顯改善COPD大鼠肺功能,見表2。

2.4 羅格列酮對各組大鼠肺臟中PI3K、p-AKT和AKT表達水平的影響 Western blot結(jié)果顯示,與C組比較,COPD組大鼠肺臟PI3K和p-AKT表達明顯上調(diào)(P<0.05),而兩組AKT表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與COPD組比較，RGZ組大鼠肺臟中PI3K和p-AKT表達進一步增加(P<0.05),而兩組AKT表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。結(jié)果顯示，羅格列酮可促進PI3K/AKT信號通路激活。

表1 RT-PCR引物序列

表2 羅格列酮對CL、FEV0.3%/FVC和MMEF的影響

注：與C組比較,**P<0.01;與COPD組比較,#P<0.05

圖1 HE檢測羅格列酮對肺組織病理損傷的影響(200×)

圖2 Western blot檢測羅格列酮對PI3K、AKT、p-AKT表達水平的影響

注：與C組比較,*P<0.05,**P<0.01;與COPD組比較,#P<0.05

2.5 羅格列酮對各組大鼠BALF中白細胞計數(shù)和中性粒細胞百分比的影響 與C組比較,COPD組BALF中白細胞計數(shù)和中性粒細胞百分比均明顯增加(P<0.05);與COPD組比較,RGZ組BALF中白細胞計數(shù)和中性粒細胞百分比均明顯降低(P<0.05)。見表3。

2.6 羅格列酮對各組大鼠肺臟TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達的影響 與C組比較，COPD組肺臟中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達水平均明顯增高(P<0.05);與COPD組比較,RGZ組肺臟中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達水平均明顯減少(P<0.05)，見表4。

表3 羅格列酮對BALF中白細胞計數(shù)和中性粒細胞百分比的影響

注：與C組比較,**P<0.01;與COPD組比較,#P<0.05

表4 羅格列酮對TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達水平的影響

注：與C組比較,**P<0.01;與COPD組比較,#P<0.05

2.7 羅格列酮對各組大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β表達量的影響 與C組比較，COPD組血清中TNF-α、IL-6和IL-1β表達量均明顯升高(P<0.05);與COPD組比較,RGZ組血清中TNF-α、IL-6和IL-1β表達量均明顯降低(P<0.05)，見表5。

2.8 羅格列酮對各組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β表達量的影響 與C組比較，COPD組BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β表達量均明顯升高(P<0.05);與COPD組比較,RGZ組BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β表達量均明顯降低(P<0.05)，見表6。

表5 羅格列酮對血清中TNF-α、IL-6、IL-1β表達量的影響

注：與C組比較,**P<0.01;與COPD組比較,#P<0.05

表6 羅格列酮對BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β表達量的影響

注：與C組比較,**P<0.01;與COPD組比較,#P<0.05

3 討論

COPD是臨床上常見的一種呼吸道氣流嚴重受限且不能完全可逆的支氣管肺部疾病,其氣流受限表現(xiàn)為緩慢而持續(xù)的進展。其致病病因包括機體抵抗力下降、過敏、反復(fù)感染、吸入有毒有害物質(zhì)以及反復(fù)嚴重感染等[1-2]。其病理基礎(chǔ)為肺實質(zhì)和支氣管的慢性炎癥,緩慢而持續(xù)的進展,引發(fā)肺功能下降乃至衰竭[7-9]。因此，抑制或減輕肺部炎癥是改善COPD的有效治療途徑。

羅格列酮為噻唑烷二酮類抗糖尿病藥,其作用機制為通過提高機體對胰島素的敏感性以控制高血糖。羅格列酮是過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPAR-γ)的強效激動劑之一，而PPAR-γ廣泛分布于肺組織等器官[3-4]。既往研究顯示，PPAR-γ激動劑可通過激活PPAR-γ核受體,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、自由基清除及血糖降解等[3-4]。因此，羅格列酮可能有助于改善COPD。

本實驗通過煙熏暴露聯(lián)合氣管內(nèi)滴入(脂多糖)的方法構(gòu)建大鼠COPD模型。模型組大鼠一般情況表現(xiàn)為毛發(fā)萎黃,大量脫落,活動性差,經(jīng)常出現(xiàn)咳嗽,飲食明顯減少,體重增加,病理學(xué)結(jié)果顯示，大鼠肺泡間隔明顯增厚,肺泡壁厚度明顯變薄,肺泡腔萎陷,管腔變窄,萎縮肺泡陷明顯增多,可見大量炎癥細胞浸潤。肺功能檢測結(jié)果顯示，CL、FEV0.3%/FVC和用力呼氣流量均明顯降低,肺組織、血清和BALF TNF-α、IL-6、IL-1β表達量明顯增加,BALF中白細胞計數(shù)和中性粒細胞百分比均明顯增高,這與既往研究報道一致[6],提示成功模擬構(gòu)建了COPD大鼠模型。本研究進一步證實了COPD可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的激活和炎癥細胞的浸潤,肺組織病理損傷,肺功能降低及臨床不適癥狀的出現(xiàn),嚴重影響患者生活質(zhì)量乃至預(yù)后。羅格列酮預(yù)處理可明顯改善大鼠一般狀態(tài),減輕肺組織病理結(jié)構(gòu)改變和肺功能的降低,減輕炎癥細胞因子表達和炎癥細胞浸潤。因此，羅格列酮對COPD大鼠有明顯的保護作用,其作用機制與抑制炎癥相關(guān),但具體機制不明。

PI3K是體內(nèi)介導(dǎo)信號傳遞的重要分子,可通過磷酸化其下游的蛋白激酶B(AKT)調(diào)節(jié)各種細胞功能，如增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化、炎癥和趨化等，并在COPD等呼吸道疾病的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[10-11]。結(jié)果顯示，COPD可以促進PI3K/AKT信號通路的激活,而羅格列酮可以進一步促進PI3K/AKT的激活,這與既往研究顯示PPAR-γ激動劑可促進PI3K/AKT信號通路的激活一致。

綜上所述,羅格列酮可通過抑制炎癥而對COPD有保護作用，其作用機制與激活PI3K/AKT信號通路相關(guān)。本研究為臨床防治COPD提供了新的選擇。