LC-MS測定結直腸癌患者血漿中5-氟尿嘧啶濃度

涂碎萍，李 獲*，陳 岷，張麗娟，鐘 磊，陳 璐

0 引言

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在西方國家其發病率居癌癥第2位，中國其發病率居第4位[1]。5-FU作為治療結直腸癌的基礎藥物[2-5]，約80%在肝臟代謝為非活性產物，受個體差異影響較大[6-7]。有研究表明，部分患者5-FU的藥物暴露存在100倍甚至更高的差異[8-10]。此外，Kline等[11-14]研究表明，5-FU血藥濃度與藥物不良反應及療效相關，通過監測患者血藥濃度，調整用量，可以獲得更好的治療效果。但在臨床長期治療藥物監測中發現，傳統HPLC分析方法既易受臨床治療周期、合并用藥、疾病狀態等因素影響，同時又易受內源物質干擾且靈敏度低[15]。因此，本研究旨在通過建立一個快速、簡便、靈敏且適用于長期檢測5-FU血藥濃度的分析方法，用于檢測晚期結直腸癌患者的5-FU血藥濃度，以提高5-FU臨床使用的安全性與有效性。

1 材料

1.1 儀器與試劑 Waters ZQ2000-LC-MS 分析儀(美國Waters 公司)、BP211D電子天平(德國Sartoriμs公司)、優普UPR-II-5T超純水器(成都超純科技有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)、高速離心機HC-2518(安徽中科中佳科學儀器有限公司)、氮氣吹干儀、超低溫保存箱；5-氟尿嘧啶(批號：100187-201203，含量≥98%，中國食品藥品檢定研究院，對照品)、5-溴尿嘧啶(批號：170109-07，含量≥98%，成都普思生物科技有限公司，對照品)、乙酸乙酯(諾爾施，含量99.8%)、甲醇(Dikma公司，含量99.9%)。

1.2 臨床資料 納入2017年3-11月在四川省人民醫院接受氟尿嘧啶為主治療的晚期結直腸癌患者，預計生存期≥3個月，納入34例，共監測72次。

2 實驗方法

2.1 色譜條件 采用Dikma-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-去離子水(45∶55)；流速：0.3 ml/min；柱溫：35 ℃；進樣量為5 μl。

2.2 質譜條件 離子源：電噴霧電離(ESI)，負離子模式(ESI-)選擇性離子監測(SIR)檢測。毛細管電壓：2.14 kV；錐孔電壓：22 V；二級錐孔電壓：2 V；六級桿透鏡電壓：0.5 V；ESI源溫度：130 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔氣流量：50 L/h。SIR 檢測：5-氟尿嘧啶m/z128.83，5-溴尿嘧啶m/z188.98。

2.3 溶液配制 精密稱取5-FU及5-Br對照品適量，以50%甲醇水定容于10 ml容量瓶中，得1 mg/ml 5-FU和5-Br儲備液。從儲備液中取適量5-FU和5-Br，用50%甲醇水定容于10 ml容量瓶中，得6 μg/ml的5-FU和4 μg/ml的5-Br的工作液，置4 ℃冰箱保存。

2.4 樣品處理 取5-FU和5-Br工作液50 μl，加入200 μl血漿，渦旋30 s，加入1 000 μl乙酸乙酯，渦旋3 min，在14 000 r/min離心5 min，取上清液40 ℃氮氣揮干，加入200 μl的50%甲醇水復溶，混勻渦旋3 min，在14 000 r/min離心5 min，取上清液進樣。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性考察 分別取空白血漿、5-FU工作液、空白血漿+5-FU、典型患者血漿樣品，除空白血漿不加內標外，其余均按“2.4”項下方法處理，進樣測定，記錄色譜。結果表明，血漿中的內源性物質對測定無干擾，色譜峰型對稱，峰寬小于0.5 min，5-FU與5-Br的保留時間分別為9.18、10.3 min，二者分離度良好，所建方法適用于復雜血漿樣品中藥物的分析，結果如圖1。

2.5.2 線性關系考察 取5-FU和內標5-Br的工作液適量，加入200 μl空白血漿，即得濃度為1 000.0、600.0、360.0、216.0、129.6、77.8、46.7、28.0、16.8 ng/ml的血漿樣品，按照“2.4”項下方法處理。以5-FU的質量濃度(X)為橫坐標、5-FU與內標峰面積之比(Y)為縱坐標進行加權(1/x2)，進行回歸分析。得回歸方程為Y=1.030 1 X+0.013 2(R2=0.999 2)，表明5-FU在1 000～16.8 ng/ml范圍內線性關系良好，定量限為16.8 ng/ml。

2.5.3 精密度與準確度 取5-FU和5-Br的工作液適量，加入200 μl空白血漿，制成低、中、高3個濃度(830、420、52 ng/ml)的血漿樣品，按照“2.4”項下方法處理，每個濃度平行制備6 份，進樣測定，連續測定3 d。結果日內和日間RSD均<10% (n=6)。見表1。

圖1 血漿中5-FU和內標5-Br的典型圖譜

注：A.空白血漿，B.0.5 μg/ml 5-FU和0.4 μg/ml 5-Br標液，C.空白血漿中加入5-FU和內標5-Br，D.30號患者血漿，E.28號患者血漿，F.典型MS圖

表1 方法的精密度與準確度(n=6)

2.5.4 基質效應與提取回收率 取5-FU和內標5-Br的工作液，加入200 μl空白血漿制成含5-FU質量濃度為52、420、830 ng/ml的低、中、高3個濃度的血漿樣品，按照“2.4”項下方法處理，進樣測定，得5-FU與內標比值A；分別取6份不同來源的空白血漿200 μl，按照“2.4”項下方法處理，加入5-FU與內標，制成含5-FU質量濃度為52、420、830 ng/ml的低、中、高3個濃度的血漿樣品，每個濃度6份，進樣測定，得5-FU與內標比值B；取5-FU和5-Br的工作液，加入200 μl的50%甲醇水，制成含5-FU質量濃度為52、420、830 ng/ml的低、中、高3個濃度樣品，進樣測定，得5-FU與內標比值C；以A/B計算提取回收率，以B/C計算基質效應。結果顯示，提取回收率和基質效應分別是93.20%～99.9%、96.20%～102.5%，均符合生物樣品分析方法要求。

2.5.5 穩定性考察 取5-FU工作液適量，以50%甲醇水稀釋，加入200 μl血漿制成含5-FU質量濃度為52、420、830 ng/ml的低、中、高3個濃度的血漿樣品，按照“2.4”項下方法處理，每個濃度平行制備6 份，分別于室溫放置1 h、-70 ℃凍存14 d、反復凍融3 次，考察穩定性。結果顯示，上述條件下5-FU的RSD均<10% (n=5)。

2.6 統計學方法 穩態血藥濃度采用平均值、中位值、標準差進行統計描述，血藥濃度和不良反應的關系采用χ2檢驗。所有統計分析均由SPSS

17.0軟件完成。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 患者信息 本試驗納入34例長期接受以5-FU為主的化療方案的晚期結直腸癌患者，男24例，女10例；年齡37～73歲，中位年齡57歲；結腸癌9例(26.47%)，直腸癌25例(73.53%)；有1處轉移12例(35.29%)，多于1處轉移22例(64.71%)；療效≤6個周期47例(65.27%)，7～12個周期21例(29.17%)，>12個周期4例(5.56%)；合并用藥中，基礎用藥11例，共23例。共監測72次，平均每個患者采血2次。患者化療期間合并使用了護肝、保腎、止吐、鎮痛、抗感染、皮質激素、升白藥、中成藥物、靶向藥物、免疫增強劑等10余類藥物，絕大部分患者合并藥物超過15種。

3.2 臨床血樣分析 患者使用5-FU化療18～30 h后，于凌晨6∶00～7∶00采集患者外周靜脈血[6]，低溫保護血液樣本，1 h內迅速分離，保存于-70 ℃。按照“2.4”項下方法處理，進行測定，得5-FU穩態血藥濃度，并計算AUC，其AUC=Css×TCL，Css為5-FU穩態血藥濃度，TCL為患者泵注5-FU的時間[13]。將采集的72個血液樣本測定的5-FU AUC繪制成直方圖，結果如圖2。將患者按照AUC大小分為4組，不同AUC與不良反應發生率見表2。

圖2 5-FU的AUC直方圖

毒性反應≤10(n=10)ⅠⅡⅢ～Ⅳ10～20(n=47)ⅠⅡⅢ～Ⅳ≥20(n=15)ⅠⅡⅢ～ⅣP值骨髓抑制300027.627.66.42033.313.30.122惡心嘔吐4060048.946.86.466.72013.3<0.001腹瀉00006.42.12000脫發000000006.7手足綜合征0002.100000

注：f：檢測總次數

34例結直腸癌患者5-FU AUC不呈正態分布，均值與中位值分別是16.5 mg·h/L、15.8 mg·h/L，標準差7.34 mg·h/L，范圍在1.6～59.2 mg·h/L，個體間差異較大。按照AUC值大小分3組，≤10 mg·h/組10例(13.9%)，10～20 mg·h/L組47例(65.3%)，≥ 20 mg·h/L組15例(20.8%)，患者5-FU AUC主要集中在10～20 mg·h/L。χ2檢驗結果顯示，各組惡心嘔吐發生率差異有統計學意義(P<0.001)，5-FU所致不良反應(惡心嘔吐)與5-FU穩態血藥濃度具有相關性。Ⅱ級以上骨髓抑制的發生率隨著AUC的增加而增高，但骨髓抑制發生率在各組之間差異無統計學意義(P=0.122)。腹瀉、脫發及手足綜合征等不良反應病例數少，未做統計學分析。

4 討論

4.1 患者樣本選擇與保存 二氫嘧啶脫氫酶(DPD)是5-FU分解關鍵酶，主要存在于肝與外周血單核細胞中，約80% 5-FU經DPD作用分解代謝為非活性產物。全血是檢測5-FU濃度最理想的樣本，但受外周靜脈血中DPD的影響，5-FU在全血中不穩定。且患者血樣采集時，受實驗條件、臨床采血及保存條件等影響，其血液樣本是否及時分離，直接影響5-FU在全血中的穩定性。預試驗發現，若采集血樣在室溫下放置超過1 h后再分離血漿，按照“2.4”項下方法處理，進樣測定。結果顯示，全血中的DPD可迅速將5-FU降解。其降解速度可能與患者DPD酶水平相關。

有研究表明，當血漿置于4 ℃及以下時，降解程度可降至最低[16]。血漿中若無血細胞混雜或分離后立即冷凍，樣本可保存數月以上，且5-FU不會發生降解。因此，本試驗采集患者樣本后，立即置于冰袋保護的低溫箱中，與冰袋隔離，防止溶血，并在1 h內分離出血漿，凍存于-70 ℃冰箱。結果表明，采用該方法采集與保存的血樣，5-FU血漿濃度未出現降解，其樣本穩定性符合要求。

4.2 影響氟尿嘧啶血藥濃度監測結果分析 研究表明，AUC的理想值范圍是20～25 mg·h/L[17-18]。但本試驗結果顯示，約80%的患者AUC低于目標值，僅約19%的患者能達到目標范圍，只有少部分患者高于警戒值，并且個體間存在較大的藥代動力學差異。這與Gamelin等[19]的一項關于轉移性結直腸癌患者的隨機對照多中心臨床研究結果一致。同時，宋衛峰等[20]發現，5-FU給藥后的血藥濃度與基于體表面積的給藥劑量之間無明顯相關性(r=0.056，P=0.217)，同時，與5-FU實際持續輸注劑量也無相關性(r=0.066，P=0.146)。而目前影響5-FU血藥濃度偏低的因素鮮有報道，依據試驗研究推測有以下原因。

4.2.1 化療后患者組織器官的損害 隨著化療周期的增加，抗癌藥物在殺滅癌細胞的同時，會對組織器官如骨髓、胃腸道、肝腎功能等有一定的損害，在一定程度上影響藥物的體內過程。

4.2.2 靜脈泵的使用 患者使用靜脈泵化療時，泵入時間長達48 h，極易出現靜脈管的壓折和堵塞，從而影響持續給藥速率。

4.2.3 化療中存在大量合并用藥 結直腸癌患者在治療時，合并使用10余類藥物，其中可能存在藥物的誘導和相互作用，如皮質類激素。隨著皮質激素的使用，可誘導肝藥酶活性的增強，從而增加了肝臟對5-FU的代謝。

因此，按體表面積給藥的方式，無法滿足患者對5-FU的實際劑量需求，通過對5-FU治療藥物監測，對其臨床劑量進行個體化調整對結直腸癌患者的治療是至關重要的。

4.3 AUC與毒性反應相關性分析 Ⅱ級以上骨髓抑制的發生率隨著AUC增加而升高，但χ2檢驗結果顯示，各組骨髓抑制發生率比較差異無統計學意義(P=0.122)，其原因可能與樣本量有關。隨著AUC的增加，腹瀉、脫發及手足綜合征等不良反應發生率呈升高趨勢，但病例數少，未做統計學分析。5-FU所致不良反應(惡心嘔吐)與5-FU穩態血藥濃度呈正相關。說明大部分患者可以通過檢測5-FU血藥濃度,調整劑量,使5-FU穩態血藥濃度維持在一定水平，預防毒性反應。5-FU血藥濃度與不良反應(骨髓抑制、腹瀉、脫發及手足綜合征等)相關性研究，還需進一步擴大樣本量。

4.4 LC-MS分析條件的選擇

4.4.1 離子模式的選擇 實驗條件摸索過程中，5-FU和5-Br內標液在正離子模式(ESI+)較ESI-模式響應值更高，但內標5-Br在ESI+模式下存在雙峰現象，干擾5-Br的檢測，故本實驗選擇ESI-模式。

4.4.2 樣本前處理方法的確立 單純使用乙腈或甲醇進行血漿樣本的蛋白沉淀，會造成檢測時5-FU峰型對稱性差且存在拖尾現象。而使用乙酸乙酯萃取后揮干復溶的前處理步驟，檢測時5-FU峰型對稱良好，同時該方法的提取回收率高且操作相對簡單，滿足對5-FU檢測要求。

4.4.3 色譜條件的選擇 色譜條件篩選時，筆者比較了乙酸銨-乙腈= 98.2∶1.8[21]、甲醇-0.1%甲酸水溶液=80∶20[15]、甲醇-0.01%乙酸水溶液=35∶65[22]等不同流動相，出現樣品分離效果不理想、峰型對稱性差、雜質峰多等現象。本實驗選擇Dikma-C18的長色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，在流動相為甲醇-去離子水(45∶55)、流速為0.3 ml/min、柱溫35 ℃的條件下，所測得的5-FU、5-Br在色譜柱上分離度良好、峰型對稱性好，且在目標物附近雜質峰少，條件簡單，易于推廣使用。

本試驗方法取血量少，血液樣本處理方法簡單，雜質分離良好，靈敏度較高，回收率高，適用于用藥復雜且接受長期放化療治療的結直腸癌患者的5-FU血藥濃度檢測。