丹皮酚GC-MS測定方法的建立及應用

易承學，曹 杰，徐 虹，徐希明，余江南

0 引言

丹皮酚(Paeonol)又稱牡丹酚，是從毛茛科芍藥屬植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.、芍藥P.lactifloraPall.的根皮和蘿摩科植物徐長卿Cynanchumpaniculatum(Bunge) Kitag.的干燥根或全草中提取出的有效成分[1]，化學名為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮，結構式見圖1。研究表明，丹皮酚在抗菌消炎、解熱鎮痛、調節免疫、抗腫瘤、抗氧化及抗過敏等方面均呈現出良好的藥理活性[2-3]，開發前景廣闊，臨床上有丹皮酚軟膏，丹皮酚(磺酸鈉)注射劑和丹皮酚片等制劑，多用于心腦血管、腫瘤、炎癥、變態反應及免疫系統等疾病[4]。但該藥存在易揮發、水溶性差、體內半衰期短及生物利用度低等不足，近年來圍繞其新劑型的研究日趨活躍[5-8]。

有關丹皮酚的測定方法中較常見的有紫外分光光度法、毛細管電泳、高效液相色譜法和氣相色譜法[9]。氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)既具備氣相色譜的高效在線分離能力，又發揮了質譜的高選擇性、高靈敏度檢測能力，專屬性強，檢測限低，是組分復雜及微量樣品分離分析最有力的研究手段，在藥物分析領域已有廣泛的應用[10-11]。藥物的溶解度是影響藥物在生物體內吸收程度和速度的重要因素之一，亦是制劑研究的重要參數，測定藥物在不同介質中的溶解度有助于指導其劑型的合理設計。本實驗采用GC-MS，以聯苯為內標，建立了丹皮酚的含量分析方法，并研究該藥在15種常用有機溶劑中的平衡溶解度，旨在為進一步設計和開發出丹皮酚新劑型提供有益參考。

圖1 丹皮酚化學結構式

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 7890A-5975C型氣質聯用儀(美國安捷倫公司)，XPE205電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，ROTINA 380R離心機(德國Hettich公司)，THZ-300型恒溫搖床(上海一恒科技有限公司)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑 對照品丹皮酚(純度99.2%，批號：C1610281)、內標正十五烷(純度99.8%，批號：F1508060)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，內標聯苯(純度99.99%，批號：G124924)購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。丹皮酚原料自制。大豆油和精制玉米油由江西益普生藥業有限公司提供，中鏈甘油三酸酯由鐵嶺北亞藥用油有限公司提供，正丁酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸乙酯、聚山梨酯20、聚山梨酯80、異丙醇、乙醇、乙二醇、聚乙二醇200和聚乙二醇400均由國藥集團化學試劑有限公司提供，聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯氫化蓖麻油由德國BASF公司提供。石油醚(35～60 ℃)由美國Tedia公司生產。

2 方法與結果

2.1 丹皮酚GC-MS測定方法

2.1.1 分析條件 色譜條件：DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度220 ℃，載氣為高純氦氣，流速1 ml/min，柱溫采用程序升溫，初始溫度50 ℃，以20 ℃/min升至220 ℃，分流比為10∶1，進樣體積為1.0 μl。

質譜條件：氣質接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，電子轟擊源(EI)電離方式，電子能量為70 eV，溶劑延遲5 min。選擇離子檢測模式(SIM)，丹皮酚的選擇離子166、151、108，定量分析離子151。聯苯的選擇離子154、153、152、76，定量分析離子154。

2.1.2 溶液的配制 內標溶液：精密稱取聯苯適量，石油醚溶解，配成2.02 mg/ml的內標溶液，置于-20 ℃保存備用。對照品溶液：精密稱取丹皮酚適量，用石油醚溶解后定容，制成5.02 mg/ml溶液，作為對照品儲備液。精密吸取該儲備液0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 ml于5 ml容量瓶中，各精密加入0.25 ml內標液，石油醚稀釋至刻度，制成系列質量濃度對照品溶液。供試品溶液：稱取丹皮酚原料50 mg，置10 ml容量瓶中，加石油醚溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取該溶液0.1 ml，置5 ml容量瓶中，精密加入0.25 ml內標溶液，石油醚定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 方法學考察 系統適用性考察：取對照品溶液與供試品溶液1 μl注入氣質聯用儀，按照“2.1.1”項條件進行分析，丹皮酚和聯苯分離良好，樣品測定無干擾。丹皮酚和聯苯的保留時間分別為7.411 min和7.035 min，質譜圖見圖2。從圖2可以看出，m/z166、151、108和m/z154、153、152、76分別為二者的主要碎片離子峰，相對豐度高，且無干擾。

圖2 丹皮酚(A)、聯苯(B)的GC-MS質譜圖

線性關系考察：取上述系列質量濃度對照品溶液各1 μl進樣分析，每種濃度的待測液連續進樣2次。以對照品與內標物質量濃度之比(x)為橫坐標，二者峰面積之比的2次平均值(y)為縱坐標，進行線性回歸分析，得回歸方程為：y=0.786 5x-0.072，r=0.999 5，表明丹皮酚在25.1～401.6 μg/ml范圍內線性關系良好。

精密度試驗:取同一對照品溶液，按照“2.1.1”項分析條件連續進樣6次，計算峰面積的RSD，考察方法的精密度。結果丹皮酚與聯苯峰面積比值的RSD為1.6%，表明本方法精密度好。

穩定性試驗:將供試品溶液置棕色瓶中于25 ℃下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h時取樣1 μl測定，計算丹皮酚含量，考察樣品的穩定性，RSD為2.4%，表明24 h內供試品的石油醚溶液基本穩定。

重復性試驗:取同一批丹皮酚原料適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，照“2.1.1”項分析條件進樣測定，內標法計算其含量。結果樣品中丹皮酚平均含量為86.7%，RSD為1.8%，說明該方法重復性好。

加標回收試驗:取已測知含量的同一批丹皮酚原料適量，按“2.1.2”項下供試品溶液濃度的80%、100%、120%分別配制低、中、高3種濃度的溶液各3份，作為供試溶液。照“2.1.1”項下分析條件測定并計算回收率。低、中、高3種質量濃度的平均回收率分別為97.0%、99.7%、102.3%(n=3)，RSD分別為2.3%、1.9%、2.5%(n=3)，表明該方法的準確度較高，符合含量測定的要求。

2.1.4 樣品含量測定 取3批丹皮酚原料，精密稱量后按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定含量。結果3批樣品的含量分別為86.7%、87.2%和87.9%。

2.2 丹皮酚平衡溶解度測定

2.2.1 溶解平衡時間考察 稱取丹皮酚約3 g至100 ml具塞三角瓶中，加入10 g大豆油后密封，置恒溫搖床中，25 ℃下100 r/min振搖，于1、2、4、6、8、12 h時間點取1 g溶液后，補足溶劑，在恒溫條件下經0.45 μm微孔濾膜過濾，精密移取50 mg續濾液至10 ml容量瓶中，添加0.5 ml內標溶液，然后用石油醚定容，GC-MS法測定，并以振搖時間(h)對丹皮酚濃度(mg/g)作圖，得丹皮酚在大豆油中的溶解平衡曲線(見圖3)。既往研究表明，丹皮酚在蒸餾水中振搖72 h方能達到溶解平衡[12]，本實驗發現其在大豆油中振搖4 h即可實現。這是由于丹皮酚是一種疏水性的小分子酚類化合物，易溶于有機溶劑，因而明顯縮短了溶解平衡時間。

圖3 丹皮酚在大豆油中振搖溶解平衡曲線

2.2.2 平衡溶解度測定 試驗中選擇15種溶劑：乙醇、異丙醇、乙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、大豆油、精制玉米油、肉豆蔻酸異丙酯、中鏈甘油三酸酯、正丁酸乙酯、油酸乙酯。取過量丹皮酚置10 ml具塞試管中，分別加入5 g上述溶劑，超聲30 min，于25 ℃下100 r/min振搖24 h，取出離心(6 000 r/min,10 min)，吸取各上清飽和溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，精密稱取適量續濾液至10 ml容量瓶中，石油醚稀釋至線性范圍內，加入0.5 ml內標溶液，定容后搖勻，取1 μl注入氣質聯用儀進行測定，代入標準曲線中計算丹皮酚在各溶劑中的平衡溶解度。據參考文獻，丹皮酚在水中的溶解度僅為0.386 mg/ml，屬于“幾乎不溶或不溶”范疇[12]，但本實驗結果顯示其在有機溶劑中的溶解度顯著增大，其中在正丁酸乙酯中最大，為376.8 mg/g，在乙二醇中最小，為21.5 mg/g。見表1。

3 討論

GC-MS含量測定采用內標法較為準確，而選擇合適的內標物很重要。本實驗對2種內標物聯苯和正十五烷在所選色譜柱上的保留時間和響應值進行了考察，結果顯示,二者的保留時間分別為7.035 min和7.689 min，出峰時間均適中，但聯苯的響應值要高于正十五烷，且價廉易得，故以其作為內標物。

表1 丹皮酚在25 ℃不同溶劑中的平衡溶解度(n=3)

徐本亮等[13]采用高效液相色譜法測定了丹皮酚在水、磷酸鹽緩沖液及甲醇等常用有機溶劑中的平衡溶解度，本次實驗就丹皮酚在表面活性劑、助表面活性劑、油相中的平衡溶解度進行了測定。鑒于丹皮酚的水溶性差，提示其普通固體制劑將在胃腸道表現出溶出速率緩慢，導致吸收差，生物利用度低下。因此，在設計新劑型時，可考慮通過制備脂質體、納米乳、納米囊和納米球等納米制劑，以及固體分散技術、包合技術等制劑新技術來提高其溶解度，進而改善生物利用度。本實驗結果顯示，丹皮酚在文中所列出的幾種表面活性劑、助表面活性劑和油相中的平衡溶解度均較大，其中在正丁酸乙酯中最大，油酸乙酯次之，這可以為制劑配伍輔料的選擇提供依據。