腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與預(yù)后的關(guān)系

杜權(quán) 董曉巧 俞文華 朱強(qiáng) 車志豪 王昊 楊定博 沈永鋒 江力

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高，預(yù)后不佳[1-3]。晝夜節(jié)律紊亂與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。時(shí)鐘基因編碼的蛋白質(zhì)可以調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律[6-7]。研究表明，時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可以改變目的基因表達(dá)狀態(tài)，從而影響腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)[8-10]。NPAS2時(shí)鐘基因?qū)儆谝职┗颍涞鞍妆磉_(dá)低水平與結(jié)直腸癌預(yù)后不良相關(guān)[11]，也預(yù)示著腦膠質(zhì)瘤患者生存期縮短[12]。NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可以降低基因相關(guān)蛋白表達(dá)，參與帕金森病的發(fā)生、發(fā)展[13]。本研究通過檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，進(jìn)而分析其與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2005年6月至2010年6月本院行手術(shù)治療的102例初發(fā)腦膠質(zhì)瘤患者為研究對(duì)象。其中男63例，女39例；年齡＞60歲42例，≤60歲60例；WHO分級(jí)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)49例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)53例；腫瘤部位：幕上86例，幕下16例；腫瘤全切除72例；術(shù)后輔助化療56例；術(shù)后輔助放療77例；腫瘤類型：星形細(xì)胞瘤68例，其他34例；腫瘤直徑＞5cm 32例，≤5cm 70例；術(shù)前卡氏評(píng)分（KPS）＜80分60例，≥80分42例。所有患者均為漢族人，均未合并其他惡性腫瘤，其直系親屬均無膠質(zhì)瘤病史。

1.2 指標(biāo)檢測(cè) 術(shù)中獲取腦膠質(zhì)瘤組織及癌旁正常組織，采用甲基化特異性PCR檢測(cè)NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。使用DNA組織提取試劑盒（規(guī)格250次，批號(hào)Z3105，美國(guó)Promega公司）提取基因組DNA，使用甲基化特異性PCR試劑盒（規(guī)格60次，批號(hào)EM101，美國(guó)Millipore公司）對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，修飾后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。時(shí)鐘基因的引物參照文獻(xiàn)[13]，產(chǎn)物于4%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在紫外儀下觀察并記錄結(jié)果。為了確定甲基化特異性PCR檢測(cè)結(jié)果，以甲基轉(zhuǎn)移酶處理的基因組DNA作為陽性對(duì)照，未經(jīng)處理的基因組DNA作為陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并計(jì)算患者5年總生存期，生存期以表示，采用log-rank檢驗(yàn)分析生存差異；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響5年總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織與癌旁正常組織NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率比較 腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率為19.6%（20/102），與其癌旁正常組織甲基化頻率5.9%（6/102）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.64，P＜0.05）。

2.2 腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床特征的關(guān)系 腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤類型、腫瘤直徑、術(shù)前KPS、腫瘤全切除、術(shù)后輔助放化療等均無關(guān)（均P＞0.05）；但與WHO分級(jí)有關(guān)，Ⅲ～Ⅳ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率明顯高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)腦膠質(zhì)瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

表1 腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與5年總生存期的關(guān)系 腦膠質(zhì)瘤患者5年總生存期為（30.4±2.0）個(gè)月，生存曲線見圖1。患者5年總生存期與其腫瘤直徑、術(shù)前KPS、WHO分級(jí)、腫瘤全切除、術(shù)后輔助放化療、腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)均有關(guān)（均P＜0.05），與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤類型均無關(guān)（均P＞0.05），見表2。

2.4 影響5年總生存期的因素 經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，腫瘤全切除與否（HR=0.585，95%CI：0.353～0.969，P＜0.05）、腫瘤直徑（HR=1.970，95%CI：1.196～3.243，P＜0.05）、WHO 分級(jí)（HR=1.786，95%CI：1.110～2.874，P＜0.05）、腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)（HR=2.115，95%CI：1.223～3.656，P＜0.05）是影響患者5年總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

圖1 腦膠質(zhì)瘤患者的生存曲線

表2 腦膠質(zhì)瘤患者5年總生存期比較

3 討論

晝夜節(jié)律是一種普遍的自然現(xiàn)象，它的存在使生物體的生理、生化、行為等生命現(xiàn)象表現(xiàn)為以24h為周期的振蕩。晝夜節(jié)律發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)是分子計(jì)時(shí)器，即晝夜節(jié)律生物鐘。它是由一組特異的核心元件組成，包括Clock、Bmal1、Pers、Crys、Tim 等基因及其相關(guān)蛋白產(chǎn)物。生物節(jié)律的基本分子機(jī)制是這些核心元件構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)。這個(gè)機(jī)制本質(zhì)上是內(nèi)源性的，但同時(shí)會(huì)受環(huán)境信號(hào)的導(dǎo)引，尤其是光信號(hào)。哺乳動(dòng)物的主生物鐘被定位在下丘腦視交叉上核，當(dāng)它受到異常刺激后，機(jī)體的晝夜節(jié)律可發(fā)生改變，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)疾病。到目前為止，維持生物鐘運(yùn)行的確切分子調(diào)控過程尚未清楚[4-7]。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與晝夜節(jié)律系統(tǒng)的紊亂密切相關(guān)，時(shí)鐘基因可能通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)來影響腫瘤細(xì)胞的增生或凋亡[8-12]。基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化是時(shí)鐘基因蛋白表達(dá)功能改變的重要方式[13]。Per1、Per2、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1和NPAS2等時(shí)鐘基因的甲基化與胃癌、肝癌和乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14-16]。關(guān)于時(shí)鐘基因甲基化的研究是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)，明確某些時(shí)鐘基因的甲基化狀態(tài)有助于研究個(gè)體化的治療手段，從而提高惡性腫瘤的治愈率。

NPAS2是晝夜節(jié)律系統(tǒng)中重要的時(shí)鐘基因，是腫瘤抑制基因[11]。NPAS2蛋白可以抑制體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞生長(zhǎng)，NPAS2的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌病理分級(jí)和預(yù)后密切相關(guān)[11]。高級(jí)別膠質(zhì)瘤NPAS2表達(dá)明顯下降，NPAS2高表達(dá)膠質(zhì)瘤患者生存期明顯延長(zhǎng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織和癌旁正常組織NPAS2基因啟動(dòng)子區(qū)均有甲基化，而膠質(zhì)瘤組織甲基化頻率明顯升高。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤類型、腫瘤全切除、術(shù)后輔助放化療、腫瘤直徑、術(shù)前KPS等均無關(guān)，但與WHO分級(jí)有關(guān)，膠質(zhì)瘤組織WHO分級(jí)越高，NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率越高。生存分析結(jié)果提示，除腫瘤全切除、WHO分級(jí)、腫瘤直徑外，NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化也是影響腦膠質(zhì)瘤患者5年總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。考慮原因是NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能會(huì)使NPAS2蛋白表達(dá)減少，從而解除對(duì)腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的抑制，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展，最終影響患者的臨床預(yù)后。

綜上所述，NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展，其甲基化程度與腦膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)，也是影響患者長(zhǎng)期生存的危險(xiǎn)因素。臨床檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織NPAS2時(shí)鐘基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，有利于分析和預(yù)測(cè)患者的臨床預(yù)后，同時(shí)協(xié)助腦膠質(zhì)瘤惡性程度分級(jí)，指導(dǎo)臨床進(jìn)一步治療。