沙利度胺對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠CD4+T細胞凋亡的影響

王趙偉 吳承龍 謝建平 肖桂榮 鐘芳芳

多發性硬化是臨床上常見的中樞神經系統自身免疫性疾病，目前缺乏特效藥[1]。沙利度胺可用于多發性骨髓瘤，且價格低廉[2-3]。近年來研究發現它在自身免疫性疾病中具有應用前景[4-5]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠是最為常用的多發性硬化動物模型。筆者前期EAE模型的動物實驗發現，沙利度胺對于改善大鼠EAE發病期癥狀具有一定的作用[6]，但關于具體作用機制還不明確。已知EAE發病時中樞髓鞘脫失、軸突損傷和預后的關系極為密切，為進一步明確沙利度胺對減輕EAE大鼠中樞髓鞘、軸突損傷的作用以及CD4+T細胞的調控機制，筆者作了本研究，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 11～12周齡雄性SD大鼠30只，體重160～180g；10～12周齡豚鼠10只，雌雄不拘，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司；堅牢藍（LFB）染液（貨號：G1030）、甘氨酸銀染色試劑盒（貨號：G1052）均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；沙利度胺（貨號：T144-1G）、完全弗氏佐劑（貨號：F5881-6X10ml）均購自美國Sigma-Aldrich公司；熒光標記的CD3（貨號：12-0030-82）、CD4抗體（貨號：17-0040-82） 均購自美國 eBioscience公司。Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（貨號：70-AP101-60）購自杭州聯科生物技術股份有限公司。小鼠抗大鼠CD4（貨號：sc-53041）、GFAP一抗（貨號：sc-33673）、小鼠IgG kappa結合蛋白偶聯辣根過氧化物酶（m-IgGκBP-HRP；貨號：sc-516102-CM）均購自圣克魯斯生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與建模 將SD大鼠分成3組（即空白對照組、模型組、藥物組），每組10只。模型組與藥物組采用皮下注射豚鼠脊髓勻漿方法制作EAE模型[7]。將豚鼠經10%水合氯醛麻醉并用0.9%氯化鈉溶液左心室灌注處死，獲得新鮮脊髓組織混入等量0.9%氯化鈉溶液后充分勻漿；再混入等量完全弗氏佐劑，用注射器抽打成油包水乳劑。將新鮮制成乳劑皮下注射于SD大鼠四肢足墊（0.4ml/只），即刻以及48h后分別腹腔注射一次百日咳毒素（1ml/次）。以EAE造模日計為第0天。而空白對照組僅注射0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 沙利度胺給藥 沙利度胺經二甲基亞砜溶解后用0.9%氯化鈉溶液稀釋，終溶液二甲基亞砜濃度為2%，沙利度胺濃度為90mg/ml。藥物組大鼠從第0天開始腹腔注射給藥，連續15d，1次/d，每次劑量按60mg/kg計。空白對照組、模型組僅腹腔注射不含沙利度胺的溶劑。

1.2.3 髓鞘及軸突特殊病理染色 第20天將SD大鼠經10%水合氯醛麻醉，利用0.9%氯化鈉溶液左心室灌注處死。脊髓組織用40g/L多聚甲醛中固定。經脫水、透明、浸蠟制成蠟塊，切片用于后續染色。LFB染色：石蠟切片，脫蠟至水；LFB染液60℃水浴預熱30min，切片浸染3～4h；切片冷卻10～15min，自來水洗；切片，70%乙醇、碳酸鋰溶液中交替分化，光鏡下控制分化程度，自來水洗；脫水、封片。甘氨酸銀染色：石蠟切片，脫蠟至水；切片在酸性甲醛浸泡5min，蒸餾水洗3次；37℃預熱的甘氨酸銀液浸泡3～5min；甩掉甘氨酸銀液，放入還原液Ⅰ數秒；切片，放入還原液Ⅱ數秒，蒸餾水洗；5%硫代硫酸鈉處理，蒸餾水洗3次；脫水、封片。在光學顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.2.4 免疫組化染色 組織切片經烤片、脫蠟、水化后，在0.01M檸檬酸緩沖液中高壓鍋加熱進行抗原修復，PBS 洗滌 3 次；滴加 CD4（1∶400）或 GFAP 一抗（1∶300），4℃過夜，PBS 洗滌 3 次；滴加 m-IgGκBP-HRP（1∶100）孵育120min，PBS洗滌3次；滴加DAB工作液，光鏡下控制顯色時間，去離子水洗滌，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。每張切片隨機取3個高倍視野（400倍）觀察陽性細胞形態、分布，并計算CD4+T細胞數量[8]。

1.2.5 流式細胞術檢測外周血CD4+T細胞凋亡情況 第20天取尾靜脈血0.5ml，經紅細胞裂解液處理獲得白細胞，細胞計數板計數，調整細胞濃度為2×107/ml；用移液器分別吸取1μl CD3、1.25μl CD4熒光標記抗體于EP管，冰上孵育30min；每管加入2ml染色緩沖液洗滌 2次；移取 5μl Annexin Ⅴ和 10μl PI；室溫孵育 5min，立刻（BD FACSAria）檢測外周血CD4+T細胞凋亡情況。

1.3 統計學處理 應用SPSS 14.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnet-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EAE發病期髓鞘及軸突損傷比較 LFB染色：空白對照組脊髓組織未見明顯髓鞘脫失，而模型組、藥物組均有髓鞘片狀脫失。其中藥物組髓鞘脫失多為局部小片狀，很少有大片髓鞘脫失，而模型組以大片髓鞘脫失多見。甘氨酸銀染色：空白對照組軸突被染成黑色，分布均勻，未見局部丟失；模型組、藥物組均可見軸突丟失，其中模型組軸突密度低于藥物組，見圖1。

圖1 EAE發病期髓鞘及軸突損傷比較（a：藥物組，LFB染色，×400；b：模型組，LFB 染色，×400；c：空白對照組，LFB 染色，×400；d：藥物組，甘氨酸銀染色，×1000；e：模型組，甘氨酸銀染色，×1000；f：空白對照組，甘氨酸銀染色，×1 000）

2.2 EAE發病期星形膠質細胞增生比較 與空白對照組比較，模型組、藥物組星形膠質細胞均有增生，其中藥物組星形膠質細胞增生反應較模型組輕，細胞體積也相對較小，見圖2。

圖2 EAE發病期星形膠質細胞增生比較（a：藥物組；b：模型組；c：空白對照組；×400）

2.3 EAE發病期外周血T細胞及凋亡CD4+T細胞比例的比較 與模型組比較，藥物組CD4+T細胞比例明顯降低，凋亡CD4+T細胞比例明顯增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而CD3+T細胞比例差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 EAE發病期外周血T細胞及凋亡CD4+T細胞比例的比較（%）

2.4 EAE發病期脊髓CD4+T細胞浸潤程度比較 空白對照組未發現CD4+T細胞浸潤，而藥物組CD4+T細胞浸潤較模型組明顯減輕，見圖3。進一步作半定量分析，藥物組 CD4+T 細胞數為（179.1±55.23）個/mm2，明顯少于模型組的（259.8±61.55）個/mm2，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 EAE發病期脊髓CD4+T細胞浸潤程度比較（a：藥物組；b：模型組；c：空白對照組；×400）

3 討論

一般認為，脫髓鞘疾病在炎癥后可通過少突膠質細胞再生進行修復，神經功能可能達到基本恢復。若多發性硬化病情較重或反復發病，多數會遺留明顯的神經缺損癥狀，造成較重的疾病負擔[9]。神經功能的永久性缺損與軸突的不可逆損傷有關[10]。

本研究發現沙利度胺治療EAE大鼠，不僅能減輕中樞髓鞘的脫失，還能減少軸突的丟失，表明沙利度胺具有潛在改善疾病預后的作用。星形膠質細胞是中樞內重要的免疫調控細胞，對于維持中樞免疫平衡、營養神經元具有重要意義[11-12]。本研究發現，沙利度胺可以抑制中樞炎癥過程中星形膠質細胞的增生，減輕炎癥反應。而星形膠質細胞的炎性增生反應是EAE發病嚴重程度的生物標志物。另一方面，本研究也提示沙利度胺可能通過調控星形膠質細胞最終減輕髓鞘及軸突損傷，從而抑制EAE發病。在發病過程中，外周CD4+T細胞可由軟腦膜侵襲至中樞組織，從而引起炎癥反應[13-14]。本研究發現沙利度胺可抑制發病高峰期過度增生的外周CD4+T細胞。此外，流式細胞術檢測結果發現沙利度胺可促進外周CD4+T細胞凋亡，降低外周CD4+T細胞比例。進一步作免疫組化染色證實，沙利度胺可抑制中樞CD4+T細胞浸潤。可見，沙利度胺可能通過促進外周CD4+T細胞凋亡，從而抑制細胞向中樞浸潤，最終減少髓鞘脫失及軸突損傷。

但是，關于確切的凋亡調控機制尚不明確。目前認為沙利度胺可以抑制腫瘤血管的增生，具有調控血管再生的功能[15]。而多發性硬化、EAE發病過程中存在血管炎癥反應，既有血管內皮的損傷、血腦屏障的破壞，又有炎性血管增生的存在[16-17]。沙利度胺可能通過調控血管內皮細胞生物反應，從而影響外周CD4+T細胞向中樞浸潤。關于沙利度胺對血腦屏障的調控作用有待進一步研究明確。

綜上所述，沙利度胺可減輕EAE大鼠發病過程中髓鞘脫失及軸突損傷，抑制星形膠質細胞過度炎癥反應，對于改善疾病預后具有一定作用。沙利度胺的免疫調控機制可能與促進外周CD4+T細胞凋亡、抑制細胞向中樞浸潤有關。