Caspase家族與細胞凋亡的研究進展

楊濤 費振海 鐘興明

細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，是細胞維持生命活動的重要過程。細胞凋亡對器官組織的生長發育、免疫、新陳代謝以及非正常細胞的清除具有重要意義。而細胞凋亡的誘導與執行需要一系列蛋白分子信號共同作用，如信號分子、受體、蛋白酶、基因等。Caspase是一種促使細胞凋亡的蛋白酶[1-2]，在細胞凋亡機制網絡中處于核心地位[3]。Caspase的活化和Caspase級聯反應能被多種凋亡抑制信號調控，如Bcl-2蛋白家族、鈣蛋白酶、Ca2+等。筆者就 Caspase家族、Caspase級聯反應系統及Caspase蛋白分子調節作一綜述。

1 Caspase的分子結構及性征

Caspase是一種半胱氨酸蛋白酶[4-5]，也是一種IL-1β轉化蛋白酶，與秀麗隱桿線蟲的細胞死亡基因CED-3具有高度同源性。目前已被發現的Caspase有14種[6]，按發現順序依次命名為Caspase-1～Caspase-14，并且它們具有部分相同的分子結構與性征：（1）都是半胱氨酸天冬氨酸酶；（2）都有一個保守的五肽反應位點′QACXG′；（3）前體蛋白都是酶原。

Caspase的N末端原結構域（Prodomain）包含著一個高度多樣化的結構。一般蛋白酶的活化通過切割Prodomain即可，但Caspase的活化不僅需要把N末端Prodomain切除，還需要在兩個亞基連接處對相對應的天冬氨酸序列位點進行切割，完全切除后的Caspase才有蛋白酶活性。兩個亞基連接處的天冬氨酸序列位點被切割后，Caspase會產生包含一個大亞基和一個小亞基的一個異二聚體，而兩個異二聚體可組成一個有酶活性的異四聚體。根據Caspase氨基酸序列的同源性及其作用性質，可將Caspase分為3個亞型，見表1。

表1 Caspase家族的亞型分類

在眾多的細胞凋亡活化者和炎癥反應調節者中，都具有一段較長且重要的Prodomain[7]，其中Procaspase-8、Procaspase-10包含死亡效應域（DED），而 Procaspase-2、Procaspase-9包含著募集結構域（CARD）。DED與CARD都是死亡結構域家族成員，它們能經過蛋白質的相互結合反應、自我活化或活化其他對應的Procaspase，進而調控下游的Caspase級聯反應。在斑馬魚Procaspase的Prodomain中，發現了與上述兩種結構域相似的熱蛋白結構域（PYD）[8]。這3種結構域都有一個共同的3D折疊結構，由6個反平行α螺旋組成。此外，有研究發現部分凋亡執行者Procaspase中的Prodomain并不參與蛋白質相互之間的結合反應[8]。

2 Procaspase的活化

Procaspase的活化路徑主要有兩種：（1）死亡信號誘導，死亡受體依賴性路徑；（2）細胞色素C誘導，線粒體調節路徑（Caspase-9依賴性路徑）。

2.1 死亡受體依賴性Procaspase活化路徑

2.1.1 Procaspase-8、Procaspase-10的死亡受體依賴性活化路徑 細胞死亡信號（如Fas配體、TNF-2）能被其位于細胞膜的特異性死亡受體（如Fas、TNFR）所識別。兩者之間的相互結合可以活化相關死亡受體，如Fas、TNFR均能與其相關性死亡結構域結合，從而導致這些相關性死亡結構域相聚合并產生大量DED。而DED又能與Procaspase-8的Prodomain中DED相互作用，誘導位于細胞質中的Procaspase-8蛋白質進行寡聚反應，最終產生大量的死亡誘導信號復合體（DISC）。在DISC中，兩個線性結構的Procaspase-8緊密結合，同時進行Procaspase-8蛋白質的自我活化。Caspase-8活化后的下游路徑具有不同的細胞類型，如在一些淋巴樣細胞系中，Caspase-8被大量活化并能直接活化下游的Procaspase；在其他細胞類型中（不同于淋巴樣細胞系），Caspase-8只被少量活化，且不能直接活化Caspase-3。然而，Caspase-8除活化Caspase-3外，還能通過切割細胞基質中的Bcl-2蛋白家族成員Bid前體來形成截斷的Bid（tBid），tBid能進入線粒體中，致使Bax等相關蛋白進行寡聚反應，誘導細胞色素C，同時凋亡誘導因子AIF及其他相關凋亡信號分子從線粒體中釋放，進而誘導細胞凋亡。

Caspase-10主要誘導淋巴樣細胞凋亡，其誘導的凋亡路徑與Caspase-8相似[9]。Caspase-10在Fas與TNF相關性誘導凋亡（如Fas相關介導的人T細胞凋亡）的過程中，能引起Procaspase-10的募集與活化，與Caspase-8同時活化并作用于下游底物。雖然Caspase-8和Caspase-10都能接受死亡受體產生的凋亡誘導信號，從而誘導細胞凋亡；但它們擁有不同的凋亡作用底物，同時面對死亡信號及其他類細胞凋亡過程中所呈現的功能也不相同。

2.1.2 Procaspase-2的死亡受體依賴性活化路徑 一旦死亡信號與其受體相結合，死亡信號受體即被活化。這些活化的死亡信號受體可通過受體相關作用性蛋白等方式募集Procaspase-2，而募集后的Procaspase-2可被活化。

2.2 細胞色素C誘導、線粒體介導性Procaspase活化路徑

2.2.1 細胞色素C誘導、線粒體介導性Procaspase-8活化路徑 除了與死亡復合體結合并自我活化外，Procaspase-8也能被其他方式活化，如細胞色素C誘導、線粒體介導途徑。當細胞色素C從線粒體釋放到細胞質中，可以通過活化Procaspase-6的Prodomain而活化Caspase-6，活化后的Caspase-6又能進一步活化Caspase-8。可見，Caspase-8的活化既能通過與死亡復合體結合實現自我活化，也能通過細胞色素C誘導、線粒體介導途徑活化。

2.2.2 細胞色素C誘導、線粒體介導性Procaspase-9活化路徑 當發生細胞應激性反應（如DNA損傷、感染）時，線粒體膜會出現腫脹、通透性增高，線粒體的通透性轉換膜開放，致使位于線粒體內的細胞色素C、AIF、Bitl等物質釋放至細胞質中[10-11]。位于細胞質中的細胞色素C、dATP、Apaf-1可與 Procaspase-9組成一種大分子混合物凋亡體。Apaf-1的N段與Procaspase-9的Prodomain均有CARD，它們按1∶1的比例進行相互作用，并組成大分子混合物。活化后的Caspase-9能活化下游的Procaspase-3、Procaspase-7，而活化后的Caspase-3又能進一步活化Procaspase-9，從而形成一種正反饋調節。

在線粒體調控活化路徑中，Apaf-1是凋亡小體最主要的組成部分。Apaf-1有3個獨特的結構域，即N段募集結構域、一個核苷酸結合域、一個WD-40功能位點片段。目前已發現4種不同的Apaf-1亞型，且它們均有上述3種特殊結構。N段募集結構域需與Procaspase-9的Prodomain相結合，從而導致Procaspase-9的募集與活化。核苷酸結合域的順序與秀麗隱線蟲的CED4相似，因此該區域又稱為CED4同源性區域，該區域存在細胞色素C與dATP的條件下，能使Apaf-1進行寡聚反應。Apaf-1單獨與dATP相結合的能力較差，但有細胞色素C的條件下，其結合能力大大增強，同時Procaspase-9對它們的結合起著推動作用[12]。WD-40功能位點片段主要涉及Apaf-1與細胞色素C的相互作用[13]。目前已有研究涉及Caspase-9的活化。在正常生理情況下，不活躍的Caspase-9主要以單體形式存在，但當Caspase-9人為形成或被Apaf-1募集，則Caspase-9二聚體的形態將導致Caspase-9的活化[14]。

3 級聯反應下游中的Caspase

上游凋亡始動者的活化能進一步活化下游的凋亡執行者。此外，活化的Caspase-8能通過切割Bid前體而形成tBid，誘導細胞色素C、AIF及其他相關凋亡信號分子從線粒體中釋放，最終誘導細胞凋亡。而活化的凋亡執行者可剪切對應相關的細胞蛋白，如聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）、核纖層蛋白（Lamin）、胞襯蛋白（Fodrin）、Bcl-2，從而促使細胞發生形態學變化。下游中參與炎癥反應的 Caspase（如 Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5）可誘導相關炎癥介質因子IL-1β轉換酶原的活化[15]。

3.1 Caspase-3、Caspase-6 和 Caspase-7 Caspase-3是最為關鍵的細胞凋亡執行者，它在細胞凋亡的過程中具有關鍵作用[16-18]。Caspase-3由Procaspase-3活化而來，而 Procaspase-3 可被 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等活化。Caspase-3的作用底物包括Procaspase-3、Procaspase-6、Procaspase-9、依賴于脫氧核糖核酸的蛋白激酶（DNA-PK）、蛋白激酶 C（PKC）、PARP等。大部分Caspase-3的作用底物均可被Caspase-3水解分離，可見Caspase-3在細胞凋亡過程中有著重要作用。

Caspase-6、Caspase-7與Caspase3具有高度同源性。Procaspase-6能被Caspase-3活化但不能被顆粒酶B活化。Caspase-6也能通過正反饋調節進一步活化Procaspase-3。Caspase-6 的作用底物包括 PARP、Lamin、Procaspase-3。Procaspase-7可被顆粒酶B活化，其作用底物包括PARP、Procaspase-6等。

3.2 下游Caspase的作用底物 下游Caspase的作用底物包括PARP、DNA-PK、U1-70kD等，它們對細胞DNA的錯配修復有著重要作用。當這些底物被Caspase分解滅活后，DNA降解將不可避免。被Caspase活化后的脫氧核糖核酸酶（CAD）是一種基本的、鎂離子依賴性的核酸內切酶。在哺乳動物DNA降解過程中，CAD起著促進作用。在正常細胞中，CAD主要位于細胞核內，并與相關特異性抑制劑結合成一種復雜的CAD抑制物（ICAD）。當發生凋亡時，Caspase-9通過某些方式損傷細胞核核孔，幫助Caspase-3進入細胞核并水解ICAD。被Caspase-3水解分離后的ICAD可釋放出CAD，從而導致DNA降解。Lamin A、Fodrin分別是細胞核、細胞質骨架的基本組成部分，它們一旦被Caspase水解分離，就會導致細胞核的濃縮、細胞核核膜的分解及凋亡小體的產生。當所有Caspase底物被分解或滅活后，細胞會產生一系列形態學改變，包括相關凋亡基因的活化、DNA錯配修復的減少、相關凋亡酶原的活化、抑制凋亡酶原的失活、細胞骨架分離、細胞核破碎等，最終導致細胞凋亡。

4 Caspase-2的功能

Caspase-2是哺乳動物中早期發現的Caspase蛋白水解酶。Caspase-2具有特殊的結構形態，它既是Caspase啟動子又是效應子。Caspase-2在細胞凋亡的早期即可出現，如DNA損傷、TNF出現及其他相關病原體或病毒感染時。Caspase-2、Caspase-9與秀麗隱線蟲的CED-3相似，都有一個高度同源性的Caspase募集結構域。Caspase-2分布在多種組織和細胞中，細胞核、細胞質內均有存在，甚至還是高爾基復合體的重要組成部分。研究發現Caspase-2在一些細胞中可充當凋亡誘導者。Read等[19]報道在一些細胞中并無細胞色素C或Apaf-1的存在，但存在著Procaspase-2自發性募集并形成蛋白質復合體，這些蛋白質復合體又能活化Procaspase-2。Procaspase-2經自我活化后，活化的Caspase-2又能進一步活化Caspase-9，從而導致線粒體內的細胞色素C及其他相關誘導凋亡因子的釋放。Gabriela等[20]研究發現在凋亡早期，位于細胞核內的Caspase-2可不離開細胞核即致使細胞線粒體功能障礙，誘導釋放細胞色素C，從而促進凋亡；只有在凋亡晚期，Caspase-2才從細胞核內轉移至胞內。Guo等[21]發現一定生理量的Caspase-2也能產生tBid，從而誘導凋亡。Bcl-2可以抑制Procapsae-2的活性，Bcl-2可以抑制線粒體內誘導因子的釋放并維持正常線粒體外膜的通透性，活化的Paspase-2可以截斷Bcl-2家族蛋白，形成tBid，進一步促進線粒體內誘導因子釋放的同時也促進了自身活化，形成一個正性反饋。可見，對于Bcl-2限制線粒體外膜通透性的功能來說，其抑制Procaspase-2活性的功能更為關鍵。此外，研究發現Caspase-2不僅與Caspase-9的活化有關，它在Fas調控凋亡過程中也能促使死亡誘導信號復合體的產生，進而促進Procaspase-8的活化[22]。

5 Caspase-12及內質網應激性誘導凋亡

內質網參與維持細胞內Ca2+濃度、合成細胞膜上蛋白等多種功能。此外，它對細胞凋亡信號的處理也有著重要作用。

Caspase-12主要集中在內質網中，并受內質網應激性反應來調節凋亡發生，它對許多神經系統性疾病的發生有著重要影響。內質網的應激性反應受多種因素的影響，如多種未折疊蛋白質累積在內質網的內腔中會擾亂Ca2+平衡，而其他藥物（如毒胡蘿卜素、順鉑類）等也可引起內質網的應激性反應。

目前發現在多種細胞類型中出現內質網應激性凋亡并促使Caspase-12的活化。在衣霉素導致的內質網應激性凋亡過程中，Procaspase-12活化，使得Caspase-12轉移至細胞核內，而Caspase-12可以進一步活化Caspase-3，最終誘導細胞凋亡。在內質網應激性反應的作用下，Caspase-7可從細胞質基質中轉移至內質網表面，通過與Procaspase-12相互作用而活化Caspase-12，在此過程中主要由于內質網失常，不受線粒體或其他部位凋亡信號的影響[23]。在內質網應激性凋亡過程中，線粒體的功能也隨之改變。Nobuhiro等[24]報道在鼠科動物細胞C2C12中，Caspase-12經內質網應激性凋亡被活化后，進而活化Caspase-9，活化后的Caspase-9再活化Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7。在這些Caspase相互活化的過程中，并未發現細胞色素C從線粒體中釋放，提示細胞色素C與Caspase-9的活化無關。

6 Caspase系統的調節因子

Caspase的活化與滅活均可被一些蛋白質、離子及其他相關類因子[如凋亡抑制因子（IAP）、Bcl-2蛋白家族、鈣蛋白酶及Ca2+、顆粒酶B、細胞因子效應調節劑A、桿狀病毒p35]所調控。

6.1 IAP IAP是哺乳動物的一種內源性Casapse抑制劑，可特異性抑制Casapse-9、Casapse-7、Casapse-3的活性，從Casapse的始動階段即開始抑制，最終達到抗凋亡的作用。目前，人體中被發現的IAP成員包括cIAP1、cIAP2、XIAP（X與哺乳動物中被抑制的凋亡蛋白質種類有關）、NIAP、Survivin和Livin。IAP家族結構的共同特點是N端含有1或3個包含70個氨基酸的桿狀病毒IAP重復序列（BIR），C端包含或不包含1個指環結構。BIR中具有鋅指結構，可與鋅離子螯合，并能與Caspase特有的氨基酸序列或連接部位的表面相結合，以達到下調與阻斷Caspase活性的作用。同時，并不是所有BIR結構蛋白都有抑制凋亡的作用，如Survivin也有一個BIR結構，但它主要起調節細胞的有絲分裂而非抑制凋亡的作用。

哺乳類動物的IAP活性也可被線粒體釋放的半胱氨酸蛋白酶活化劑（Smac/DIABLO）所抑制。Smac/DIABLO的N段存在著一段4個殘基序列（Ala1-Val2-Pro3-Ile4），能使其識別并與已結合XIAP的Caspase-9相結合，促使XIAP失活，從而逆轉XIAP對Caspase-9的抑制作用。此外，Uren等[25]報道位于酵母菌中的IAP既沒有與Casapse結合的功能，也沒有促進細胞凋亡的作用。

6.2 Bcl-2蛋白家族 Bcl-2蛋白家族是一類凋亡調控蛋白質[26-27]。根據Bcl-2蛋白家族功能及結構的不同，可分為兩大類：（1）第一類Bcl-2蛋白為抑制凋亡的蛋白質，包括哺乳動物中的 A1/Bfl1、Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xL、Boo/Diva、Mcl-1、NR-13、Nrf3，細菌中的 BHRF-1、E1B19K、Ks-Bcl-2、LMW5-HL、ORF16，秀麗隱線蟲中的CED-9；（2）第二類Bcl-2蛋白為促進凋亡的蛋白質，包括哺乳動物中的 Bad、Bak、Bax、Bcl-rambo、Bcl-xS、Bid、Bik、Bim、Blk、BNIP3、Bok/Mtd、Hrk、Nip3，秀麗隱線蟲中的Egl-1。第一類Bcl-2蛋白都有4個短小的Bcl-2 同源結構域，即 BH1、BH2、BH3、BH4；此外，它們抑制凋亡作用的主要機制是抑制Bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白的功能。第二類Bcl-2蛋白中的Bax、Bak，主要位于細胞質內，在凋亡程序開始時可轉移至線粒體外膜上，并在轉移的過程中發生一些形態變化、寡聚反應并嵌入線粒體外膜中，從而提升線粒體通透性轉移膜的滲透性。第一類Bcl-2蛋白能通過抑制Bax蛋白活性來阻止其嵌入到線粒體外膜上，維持線粒體通透性轉移膜的正常滲透性，進而阻止相關線粒體促凋亡因子如細胞色素C、AIF、Smac/DIABLO的釋放。通過抑制上述促凋亡因子的釋放，Bcl-2蛋白家族可抑制Caspase蛋白的活性，進而起到抗凋亡的作用。

6.3 鈣蛋白酶及Ca2+鈣蛋白酶是一種Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白酶，屬木瓜蛋白酶類。目前普遍認為在細胞壞死與細胞凋亡過程中存在鈣蛋白酶的活化。鈣蛋白酶和Casapse-3具有部分共同的作用底物，如Fodrin、Ca2+依賴性蛋白激酶、ADP-核糖轉移酶/PARP。在內質網應激性凋亡過程中，鈣蛋白酶的作用尤為明顯。當老鼠大腦單側存在局部缺氧時，鈣蛋白酶首先將Procaspase-3分解成有活性的29kDA片段，然后進一步活化Caspase-3[28]。順鉑類藥物是一種腫瘤化療藥，它能導致內質網應激性凋亡的產生，在此凋亡過程中，Procaspase-12的活化依賴于Ca2+濃度及鈣蛋白酶的活性。此外，鈣蛋白酶也能分解Bcl-xL，使其從抑制凋亡狀態轉變為促凋亡狀態[29]。

6.4 顆粒酶B、細胞因子效應調節劑A及桿狀病毒p35 顆粒酶B是一種絲氨酸蛋白酶，它在細胞毒性T細胞的凋亡過程中起著關鍵作用。顆粒酶B可活化各種 Procaspase（如 Procaspase-3、Procaspase-7、Procaspase-8、Procaspase-9、Procaspase-10），從而促進凋亡的發生。Barry等[30]發現顆粒酶B可以分解相關Bcl-2家族蛋白，開啟線粒體介導凋亡途徑。

細胞因子效應調節劑A是一種從牛痘病毒分離出的絲氨酸蛋白酶抑制劑，可以抑制顆粒酶B的活性。細胞因子效應調節劑A對Caspase-1、Caspase-8的抑制作用較強，對Caspae-3、Caspase-6的抑制作用較弱，同時它可以阻止Fas與配體交聯并滅活顆粒酶B。

桿狀病毒p53可與Caspase-1～Caspase-8相結合，并滅活這些蛋白活性，作用范圍較廣。但目前尚未明確p53與這些Caspase蛋白相結合的機制，以及它們與相關促進或抑制凋亡因子的關系。

7 小結

細胞凋亡對生理性胚胎發育、免疫細胞分化、自身免疫系統維持、腫瘤發生及神經系統損傷等具有重要意義。而Caspase家族在細胞凋亡過程中居于重要地位。筆者就近年來Caspase相關研究進展作一綜述，以進一步提高對Caspase分子結構的認識，加深對Caspase參與細胞凋亡過程的理解，為未來治療腫瘤、自身免疫性疾病、神經系統疾病等提供突破口。