齊墩果酸在小鼠酒精性肝纖維化中的作用機制

王 宇 馮世兵 宋素貞 王洪波

(北京市和平里醫院，北京 100013)

核轉錄因子相關因子(Nrf)2通過介導Ⅱ相解毒酶和一系列抗氧化酶，如谷胱甘肽-s-轉移酶(GST)、血紅素氧合酶(HO)-1、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的表達，從而降低各種藥物、細菌、毒素及化學致癌物的肝毒性〔1～3〕，是肝臟防御氧化應激的最重要調節因子。齊墩果酸是五環三萜類化合物，廣泛分布于自然界近200種植物中，生物活性較多〔4〕，試驗證實具有保肝作用〔5〕。研究證明三萜類化合物對Nrf2有激活作用〔6〕。本研究通過檢測Nrf2在小鼠肝臟中表達水平，探討齊墩果酸抗纖維化作用分子生物學機制。

1 材料和方法

1.1材料 雌性昆明小鼠30只，野生型SPF級，體重20～25 g，在山東大學第二醫院的動物實驗中心飼養。美國Abcam公司抗Nrf2兔抗鼠多克隆抗體(ab53019)、纖維連接蛋白(FN)，上海基因有限公司的兔/鼠通用型二抗免疫組化試劑盒(GK500705)、日本Olympus公司全自動生化分析儀等。

1.2動物模型制備和分組方法 實驗小鼠均飼養1 w，溫度、濕度等條件完全相同。適應環境后隨機分為3組：A組(對照組)：10只；B組(模型組)：10只，每天應用濃度50%乙醇灌胃1次，12 ml/kg(4.8 g/kg)；C組(治療組)：10只，乙醇灌胃方法同B組。齊墩果酸提前1天開始灌胃，1次/d，用量20 mg/kg。本實驗獲我院實驗動物倫理委員會批準。

1.3標本采集 于12周末，天平稱重，小鼠均12 h禁食(不禁水)，給予水合氯醛麻醉(0.3 ml/100 g)腹腔注射，心臟穿刺方法取血，以3 000 r/min離心20 min(離心半徑：104 mm)留取血清，-80℃冰箱保存。肝臟標本2/5部分以10%的甲醛溶液固定備用。3/5部分液氮快速冰凍后儲存于-80℃冰柜中，用于制備RNA懸液等。

1.4血清生化指標的檢測 血清標本送生化檢測中心，由專業實驗員使用生化分析儀分別檢測小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)和總膽紅素(TBIL)水平。

1.5病理學檢查 肝組織常規固定、石蠟包埋、切片(厚度約3.5 μm)。小鼠均制作3～5張肝臟標本的組織切片，顯微鏡下根據HE及MT染色不同，選擇不同的放大倍數，每片拍攝5個不互相重疊的視野。慢性肝損害評分標準參照Thompson分級，在低倍鏡下(×100)觀察肝細胞炎癥及壞死情況。具體評分標準，炎癥情況：無炎癥細胞浸潤為0分，炎細胞稀疏分布在壞死區域連接處為1分，炎細胞常見為2分，中性粒細胞占優勢為3分，淋巴細胞占優勢為4分。肝細胞損害情況：無肝細胞壞死為0分，以局灶性肝細胞壞死為主為1分，肝細胞呈現區域性壞死為2分，連續細條形或呈補丁樣壞死為3分，大片樣或融合的區域性肝細胞壞死為4分。采用盲法獨立閱片由2名熟練病理學教授完成，取平均值。

1.6肝組織細胞外基質蛋白(FN)沉積情況。FN應用SP方法做免疫組織化學染色。胞質內出現黃棕色顆粒判定標準為陽性結果。應用圖像分析系統(HPIAS)進行分析(每片隨機選擇不相重疊5個高倍視野)。

1.7Nrf2的檢測 連續切片法將固定好的肝組織包埋后做4 μm組織切片，免疫組化采用EnVision染色法，PBS替代一抗作陰性對照，稀釋濃度為1∶300，已知陽性片作陽性對照。肝細胞胞質出現棕色顆粒結果判定標準為陽性，每張組織切片隨機選擇5個不相重疊高倍鏡視野，選 5個高倍視野計算陽性百分比的平均數。病理組織切片染色結果判定及閱片方法同上。

1.8數據處理 采用SPSS16.0軟件進行方差齊性檢驗、ANOVA單因素方差分析、Mann-WhitneyU檢驗、非參數秩和檢驗。

2 結 果

2.1各組ALT、AST、TBIL水平比較 B組ALT、AST、TBIL均顯著高于A組(P<0.05)，C組ALT、AST、TBIL均顯著低于B組(P<0.05)。見表1。

表1 ALT、AST、TBIL水平及Nrf2 表達情況

與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05，下表同

2.2各組HE染色結果比較 A組肝細胞形態、小葉結構和匯管區均未見異常。B組：肝臟小葉內炎癥細胞浸潤以淋巴細胞為主，偶見少量中性粒細胞浸潤。肝細胞見散在的多發灶狀甚至結節樣壞死，變性嚴重。C組較B組組織學情況明顯改善。見表2、表3、圖1。

表3 各組肝細胞損傷比較(n=10，n)

2.3肝臟組織MT染色結果 A組肝臟組織纖維化(藍色)極輕，僅有少量，位于血管周圍。C組及B組纖維化范圍形態學測量分析差異有統計學意義〔(1.86±1.23)%vs(3.55±1.37)%，P<0.05〕。B組纖維化范圍形態學測量分析較A組(0.03±0.02)%顯著增加(P<0.05)。B組肝組織見較多增寬的纖維組織分割并且相互連接，位于匯管區及中央靜脈周圍。C組纖維化分隔纖細，范圍較B組明顯減小，見圖2。

圖1 肝組織炎癥情況(HE，×200)

2.4FN免疫組化染色 A組極少量FN表達〔(0.05±0.03)%〕。B組FN表達較A組明顯增強(P<0.05)。C組與B組FN表達差異顯著〔(2.32±1.13)% vs (5.17±2.05)%，P<0.05〕。見圖3。

2.5Nrf2表達情況 B組較A組Nrf2表達明顯增強(P<0.05)，而C組明顯強于B組(P<0.05)。見表1及圖4。

圖2 肝組織纖維化情況(MT，×100)

圖3 肝組織FN表達情況(DAB，×100)

圖4 肝組織Nrf2表達(DAB，×400)

3 討 論

酒精性肝病是臨床常見病，傳統分為酒精性脂肪肝、肝纖維化、酒精性肝炎、肝硬化。本研究通過酒精灌胃方法模擬飲酒，利用乙醇引發氧化應激原理，12 w后成功構建了昆明小鼠肝纖維化模型。乙醇誘導產生的氧化應激機制是其在代謝過程中干擾能量代謝(線粒體三羧酸循環及脂肪酸代謝)，產生大量活性氧自由基(ROS)、細胞色素酶P450(CYP2E1)誘導產生的羥乙基自由基(HER)、耗竭還原性谷胱甘肽繼發抗氧化屏障損傷及耗竭Kuffper 細胞共同作用結果〔7〕。氧化應激反應導致線粒體膜的通透性增加，肝細胞對腫瘤壞死因子(TNF)-α的敏感性增加，從而促進肝細胞發生壞死或凋亡。ROS尚可引發脂質過氧化反應，組織蛋白變性和DNA的損傷。肝星形細胞(HSC)的激活引發了促纖維化因子的釋放及膠原合成基因的表達，脂質過氧化物及HER繼發各種免疫異常，導致肝組織慢性炎癥“永久化”，最終發生肝纖維化〔8〕。Nrf2屬于b-ZIP家族，是調節抗氧化應激反應的重要轉錄因子。Nrf2調節肝內諸多細胞抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶等基因的基礎表達和誘導表達，生理狀態下與胞質中的抑制因子Keap1結合處于抑制狀態。Keap1在C273等部位存在巰基，氧化應激導致其失去電子，形成二硫鍵，從而構型發生改變，Nrf2與Keap1解耦聯后轉移入核與抗氧化反應元件結合，啟動下游的抗氧化酶基因及Ⅱ相解毒酶的表達，包括GST、HO-1、SOD、CAT，醌氧化還原酶(Nqo)1等，增加細胞抵抗氧化應激的能力〔9〕。同野生鼠(Nrf2+)相比，Nrf2基因敲除小鼠(Nrf2-)對四氯化碳損害修復延遲，炎癥反應及纖維化程度明顯增強〔10〕，對乙酰氨基酚引起的肝損傷較敏感，脂質過氧化和DNA損傷增加，肝細胞壞死程度和乙酰氨基酚毒性反應均增加〔11〕；肝臟切除后的肝細胞增生延遲，凋亡增加〔12〕。作為引起肝細胞損傷最常見的氧化應激因素的乙醇能誘導Nrf2表達。Lamle等〔13〕研究表明這是肝細胞對氧化應激一種適應性保護反應。齊墩果酸能顯著促進酒精灌胃小鼠肝細胞Nrf2基因表達，推測在與氧化應激密切相關的肝纖維中，齊墩果酸保護肝細胞作用機制是通過增強Nrf2表達實現的。研究表明三萜類化合物可作為Nrf2基因的特別誘導劑，其通過激活Nrf2抑制黃曲霉毒素誘導的肝臟癌變過程〔14，15〕。CDDO-IM是一種人工合成三萜類化合物，能顯著降低內毒素誘導的炎性反應水平及死亡率，具體機制與激活Nrf2途徑有關。CDDO-IM預處理小鼠能通過誘導Nrf2及下游的抗氧化基因表達減輕乙酰醋氨酚導致的各種肝損害〔6〕。

乙醇代謝過程中產生了大量的ROS及HER，導致肝組織大量炎細胞浸潤及促炎因子產生，HSC被激活轉化，合成大量FN；細胞外基質在竇周間隙的大量沉積導致纖維化發生。本研究證實，齊墩果酸能顯著降低酒精灌胃小鼠的血清ALT、AST、TBIL水平，減輕肝細胞的炎癥損傷和肝組織纖維化過程。其抗纖維化分子機制可能是通過增強Nrf2的表達，加強Ⅱ相解毒酶和各種抗氧化基因表達，減弱氧化應激，減少炎細胞浸潤，阻止HSC的激活，從而抑制細胞外基質合成并增加降解，減少細胞外基質(例如FN)的產生和蓄積而實現的。Nrf2對肝細胞增殖與凋亡、信號傳導通路及活化等作用機制是未來研究的方向。齊墩果酸有效成分(三萜類化合物)提純，人工合成及改良研究也是未來研究方向。