蒙藥薩麗嘎日迪對糖尿病伴蛋白尿大鼠腎組織VEGF和血清TGF-β1的調節作用

娜日蘇 韓志強 安 達 巴圖德力根

(內蒙古民族大學附屬醫院蒙醫臨床藥理研究所，內蒙古 通遼 028000)

糖尿病伴腎損害是糖尿病最嚴重最常見的微血管并發癥之一，不加控制會發展為糖尿病腎病(DN)，是糖尿病患者致死的主要原因之一〔1〕。糖尿病伴腎損害屬于蒙醫“希京病”范疇，蒙醫學認為該病是由于三根七素之平衡失調而巴達干偏盛并與赫依交博，導致肝腎燥熱而功能衰退，精華與糟粕分解失常所致的一種遷延難愈的病癥〔2〕。蒙藥薩麗嘎日迪源自蒙醫經典著作《至高要方》，具有清腎熱，消“黏”，固精功能，主要用于腎寒腎熱諸癥，腰膝疼痛，夢遺滑精，睪丸腫大〔3〕。研究顯示，血管內皮生長因子(VEGF)與DN早期腎小球的病理變化、血管內皮功能病變相關〔4〕。本課題采用鏈脲佐菌素(STZ)所致大鼠糖尿病模型，研究蒙藥薩麗嘎日迪對糖尿病伴蛋白尿大鼠腎組織修復作用及對腎組織VEGF表達和血清轉化生長因子(TGF)-β1的調節作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及用藥 Wistar大鼠，封閉群，SPF級，170～190 g，雄性，70只，購自長春市億斯實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(吉)-2011-0004。薩麗嘎日迪：由藏紅花，訶子，制草烏，木香，白豆蔻，石菖蒲，大蜀季，刀豆，牛膽粉等17種藥材組成，購自內蒙古民族大學附屬醫院制劑室(批準文號：哲衛準字9804-33)。

1.2主要試劑及儀器 STZ(規格：100 mg，北京拜爾迪生物公司，純度≥98%，-20℃保存)，大鼠微量白蛋白(mALB)、TGF-β1酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海滬尚生物有限公司，批號：201501)，超敏電化學發光(ECL)試劑盒(武漢博士德工程有限公司，批號：20150121)。VEGF(Ⅰ抗，Abcam，批號：20150101)，兔多克隆抗體(Ⅰ抗，Abcam，批號：20150302)，PM2235萊卡組織切片機、EG1150H萊卡包埋機(萊卡公司)，MULTISKANMK3全自動多功能酶標儀(芬蘭)，WD-9413B凝膠成像系統DYY-6D型電泳儀電源、DYCZ-24DN型迷你垂直電泳儀和DYCP-40D型電轉儀(北京六一廠)。

1.3動物模型及分組 將50只Wistar大鼠適應實驗室1 w后，禁食不禁水12 h，大鼠腹注1% STZ檸檬酸溶液50 mg/kg，72 h后采尾靜脈血，空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖≥〔5〕為造模成功。將造模成功的40只Wistar大鼠按體重分為模型組14只，薩麗嘎日迪低劑量組13只、高劑量組13只。另取20只Wistar正常大鼠，按體重分為空白組10只、空白給藥組(空白組+薩麗嘎日迪高劑量組)10只，空白組和模型組灌胃同等體積蒸餾水。薩麗嘎日迪低、高劑量組分別以100 mg·kg-1·d-1和220 mg·kg-1·d-1，每日1次灌胃薩麗嘎日迪。空白組灌胃同等體積的蒸餾水，空白給藥組(空白組+薩麗嘎日迪高劑量組)以220 mg·kg-1·d-1每日1次灌胃薩麗嘎日迪，灌胃體積為10 ml/kg，連續灌胃84 d。實驗期間大鼠共死亡11只，剩49只，空白組9只，模型組11只，薩麗嘎日迪低、高劑量組分別10只和11只，空白給藥組8只。

1.4指標測定 最后一次給藥后禁食不禁水12 h，用代謝籠收集24 h尿液，-80℃保存；腹腔注射水合氯醛0.03 ml/kg麻醉，從腹主動脈取血，以3 000 r/min，離心10 min，取血清，-80℃保存，用ELISA檢測尿液mALB含量和血清TGF-β1含量；取左側腎臟，用濾紙吸干腎表面血液，置于10%甲醛溶液固定，脫水脫蠟，包埋，制作4 μm厚石蠟切片，做腎組織HE及PAS染色；取右側腎臟，-80℃保存，采用Western印跡檢測VEGF蛋白的表達。操作步驟：稱取右側腎臟，按總蛋白提取試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒說明書，提取蛋白并定量，SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離，然后轉至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加抗VEGF單抗(1∶1 000，TBS稀釋)或β-actin單抗(1∶500，TBS稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗一抗3次，加二抗(1∶2 000，TBS稀釋)，TBST洗一抗3次，用超敏ECL化學發光法顯影，壓X感光膠片，曝光，顯影定影，采用X感光膠片用凝膠成像系統對條帶進行掃描，分析條帶中吸光度值，以目的蛋白VEGF和β-actin內參照吸光度值的比值用于統計分析。

1.5統計方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1各組大鼠24 h尿mALB的比較 與空白組比較，模型組24h尿mALB明顯升高，與模型組比較，薩麗嘎日迪各組24 h尿mALB明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組血清TGF-β1的比較 與空白組比較，模型組血清TGF-β1明顯升高，與模型組比較，薩麗嘎日迪各組血清TGF-β1明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組24 h尿mALB、血清TGF-β1水平比較

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.3各組腎組織病理變化 HE染色結果表明，空白組腎小球大小適中、結構清晰，腎小管及間質未見病理改變；模型組腎小球肥大，腎小球的細胞增生明顯，系膜基質增生，系膜區擴大，腎小管上皮細胞可見空泡變性，間質可見水腫；與模型組比較，薩麗嘎日迪各組腎組織腎小球系膜基質增生減少，見圖1。PAS 染色結果表明，空白組腎小球、腎小管及間質未見病理改變；模型組腎小球肥大，腎小球基底膜增厚、系膜基質增多，腎小管上皮細胞糖原顆粒變性明顯；各治療組腎小球基底膜、系膜均有不同程度增生，病變情況好于模型組，見圖2。

2.4各組大鼠腎組織VEGF蛋白表達的變化 與空白組VEGF蛋白表達(0.84±0.06)比較，模型組VEGF蛋白表達水平明顯升高(0.98±0.05)，與模型組比較，薩麗嘎日迪低、高劑量組及空白給藥組腎組織VEGF蛋白表達水平明顯下降(0.89±0.08、0.92±0.03、0.87±0.07)，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 各組大鼠腎臟病理變化(HE，×200)

圖2 各組大鼠腎臟病理變化(PAS，×200)

A：空白組；B：模型組；C：薩麗嘎日迪高劑量組；D：薩麗嘎日迪低劑量組；E：空白給藥組圖3 各組大鼠腎組織VEGF蛋白表達的變化

3 討 論

DN是糖尿病最常見、最嚴重的微血管并發癥之一，也是造成終末期腎病(ESRD)的最常見原因之一，有20%～40%的糖尿病患者最終會發展到DN階段〔6〕。由于其發病機制不明確，尚缺乏理想的治療方法。研究表明，早期DN的特征是尿液中白蛋白排泄率輕度增加，逐步進展至大量白蛋白尿上升，最終發生腎衰竭〔7〕。近年研究發現，除高血糖和脂質代謝異常外，尚有免疫機制炎癥因子和血管新生等也參與了DN的發病〔1〕。 mALB是常用的腎小球濾過功能早期受損的一個敏感、可靠指標，其可以反映腎小球的早期的輕微損害〔8，9〕。白蛋白分子是一種可以通過腎小球濾過膜的最小蛋白質，通常濾過膜后幾乎被近曲小管全部吸收，因此正常機體的尿液中的排泄量微乎其微，但當腎小球發生病變后，腎小球基底膜上的負電荷乙酰硫酸肝素等物質的分泌會減少，破壞了濾過屏障，導致濾過量與腎小管吸收量間的平衡被打破，這樣就導致了尿液中的白蛋白排泄量升高。由此說明尿白蛋白的檢測是糖尿病患者腎功能損傷的早期診斷指標之一，同時也是反映患者的腎功能損傷程度的重要監測指標〔10〕。mALB可作為目前糖尿病早期腎損傷優選診斷指標〔11〕。本研究表明，薩麗嘎日迪對糖尿病早期腎損傷大鼠24h尿mALB有降低作用，使腎組織腎小球系膜基質增生減少，糖原顆粒聚集少。

TGF-β1是腎小球硬化及腎纖維化共同通路的主要介導因子，在所有的DN患者中均可見TGF-β1活化。TGF-β1可促進腎臟固有細胞肥大，加速ECM分子合成，并還具有促纖維黏連蛋白(FN)、Ⅰ、Ⅳ膠原蛋白表達，促細胞基質(ECM)集聚及纖維化的效用，其表達水平與DN患者腎纖維化程度有關〔12〕。本實驗說明薩麗嘎日迪對DN大鼠血清TGF-β1有抑制或降解作用。

VEGF是一種內皮細胞特異性的絲裂原，已發現VEGF與DN的發生發展密切相關。有研究表明，系膜區VEGF表達增加可促進系膜區蛋白外滲，血管外基質增加而導致系膜區體積增大。另外，VEGF也可引起內皮細胞形態改變，通過影響細胞信號轉導及細胞間轉運來調節蛋白尿的形成〔13〕。給予 VEGF單克隆抗體或血管生成抑制劑可緩解實驗性糖尿病鼠腎高濾過、腎臟萎縮、腎重和白蛋白排泄，提示VEGF與DN階段的血管結構改變，血管新生有關〔12〕。因此，抑制VEGF的過表達對延緩DN的發生、發展和轉歸有著重要的理論意義和臨床價值。本實驗表明，糖尿病腎損傷大鼠腎臟組織VEGF的表達明顯增多，薩麗嘎日迪可以有效降低DN大鼠腎組織VEGF的異常表達。