血管緊張素Ⅱ對巨噬細胞移動抑制因子mRNA表達的影響

王艷寧 王旭光 張 珉 韓 瑩 吳 凡

(沈陽醫學院基礎醫學院病理教研室，遼寧 沈陽 110034)

動脈粥樣硬化是一個包括免疫系統、血管細胞及某些器官的慢性炎癥性疾病〔1〕。目前已知內皮細胞、白細胞和平滑肌細胞在動脈粥樣硬化炎癥過程中起著決定性的作用，最近研究也證實許多組織和器官能產生一些可溶的炎性介質〔2〕。一些細胞因子、趨化因子、生長因子可調節炎癥進程，同時內分泌激素也參與了炎癥活動〔3，4〕，腎素-血管緊張素(Ang)-醛固酮系統(RASS)在其中起到了重要作用〔5〕。AngⅡ是RASS中的活性肽產物，參與了動脈粥樣硬化的發生、發展〔6〕。巨噬細胞移動抑制因子(MIF)是許多急性和慢性炎癥性疾病的前炎癥調節因子，能抑制巨噬細胞的游走，促進巨噬細胞在炎癥局部浸潤，也是體內唯一能對糖皮質激素的抗炎性作用起負調節作用的物質〔7〕。本研究觀察AngⅡ能否調節巨噬細胞MIF的表達，同時觀察AngⅡ對MIF表達的調節是否能通過核因子(NF)-κB通路來實現。

1 材料與方法

1.1主要材料 THP-1細胞是由日本山梨大學醫學部分子病理教研室惠贈。胎牛血清購于天津TBD公司，RPMI1640購于美國Hyclone公司，AngⅡ購于美國CS BIO公司，吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(PDTC)、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、佛波酯、核漿蛋白抽提試劑盒、Histon H3抗體購于上海碧云天公司，CD68抗體購于福州邁新公司，NF-κBp65抗體購于美國Santa Cruz公司，real time RT-PCR試劑盒和RNA抽提試劑盒購于大連寶生物公司，PCR引物為Invitrogen公司合成。

1.2THP-1來源的巨噬細胞的培養和鑒定 THP-1細胞的培養：將THP-1細胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，在37℃及5%CO2條件下培養。THP-1細胞懸浮生長。將THP-1細胞誘導為巨噬細胞：在含有THP-1細胞的培養液中加入50 ng/ml的佛波酯，培養48 h，可見大部分THP-1懸浮細胞分化成貼壁生長的巨噬細胞。巨噬細胞的鑒定：在培養皿中放入蓋玻片，THP-1細胞經佛波酯刺激后貼壁生長。48 h后將細胞取出，以4%多聚甲醛固定30 min后進行免疫細胞化學染色，一抗為CD68，4℃過夜，吸出一抗后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗干凈加入二抗，室溫孵育1 h，PBS沖洗干凈，二氨基聯苯胺(DAB)染色。CD68染色陽性的即為巨噬細胞。

1.3分組方法 THP-1細胞經佛波酯刺激轉化為巨噬細胞后進行分組。第一組包括對照組、AngⅡ 1×10-8mol/L組、AngⅡ 1×10-7mol/L組、AngⅡ 1×10-6mol/L組、AngⅡ 1×10-5mol/L組共5份。第二組包括對照組、AngⅡ(1×10-6mol/L)組、AngⅡ(1×10-6mol/L)+PDTC組、PDTC組共4份。AngⅡ+PDTC組先用1×10-5mol/L PDTC刺激30 min，再加入AngⅡ，作用時間為24 h。PDTC是NF-κB的特異性阻斷劑。

1.4Western印跡檢測巨噬細胞核內NF-κB的表達 核漿蛋白分離：操作步驟按照核漿蛋白分離試劑盒說明書進行。蛋白濃度的測定(BCA法)：將蛋白標準配制成25 mg/ml的蛋白標準溶液，稀釋至終濃度為0.5 mg/ml。按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B配制適量BCA工作液。標準品按0，1，2，4，8，12，16，20 μl加到96孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20 μl。將各孔加入200 μl BCA工作液，于37℃放置30 min。測定A562，依據標準曲線計算樣品的蛋白濃度。

十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)：配制5%的濃縮膠與10%的分離膠；取將要上樣的蛋白樣品60 μg/孔，將6倍上樣緩沖液與蛋白樣品混合。樣品漂浮于自來水中，慢慢煮沸5 min，取出后立即放置于冰上，防止蛋白復性。12 000 r/min離心以去除殘渣；垂直凝膠電泳分離不同分子量的蛋白質，濃縮膠80 V，30 min，分離膠120 V，當Marker的綠色條帶跑至膠中部時，停止電泳。

Western印跡步驟：制作“三明治”并開始電轉膜，50 V及120 V，1～2 h轉印；取出聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，漂洗后放入含5%脫脂奶粉的T-PBS中封閉，室溫下搖晃1 h；洗膜3次，每次5 min；將膜置入含NF-κBp65(1∶500)和Histon H3(1∶500)的一抗中，在搖床上孵育，4℃過夜；洗膜3次，每次5 min，將膜置于二抗溶液中(二抗濃度1∶1 000)，孵育1 h；凝膠成像儀成像。

1.5Real time RT-PCR方法檢測巨噬細胞MIF mRNA的表達 用RNA抽提試劑盒提取第二組細胞的總RNA，并用核酸分析儀分別檢測其含量和純度。取1 μl RNA進行反轉錄合成cDNA，之后再取3 μl cDNA進行PCR反應。MIF上游引物5′-GACATGAAC GCGGCCAAT-3′，下游引物5′-GGGTCCCTGCGGCTCTTA-3′。GAPDH上游引物5′-AGAAGGCTGGGGCTACATTTG-3′，下游引物 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′；反應條件：95℃ 30 s，1個循環；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個循環。用內參引物GAPDH的CT值對樣本的拷貝數進行校正，并用2-ΔΔCT法計算出MIF mRNA與GAPDH mRNA的相對表達量。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1巨噬細胞的鑒定 THP-1細胞為懸浮生長的圓形細胞，給予佛波酯刺激后貼壁，并從胞體伸出偽足。免疫細胞化學染色結果顯示：一抗滴加CD68抗體(圖1)，細胞內染成棕黃色，證實THP-1細胞已轉變為巨噬細胞。THP-1細胞經佛波酯刺激后出現偽足，CD68染色后可見細胞內為棕黃色。

圖1 巨噬細胞鑒定(DAB，×400)

2.2AngⅡ對巨噬細胞核內NF-κBp65表達的影響 Western印跡檢測細胞核內NF-κBp65蛋白的表達，結果顯示：伴隨AngⅡ濃度的升高，NF-κBp65蛋白的表達逐漸增強(圖2)，可見隨著AngⅡ濃度的增高，NF-κBp65的表達逐漸增強。

1～5：對照組、AngⅡ1×10-8mol/L組、AngⅡ1×10-7mol/L組、AngⅡ1×10-6mol/L組、AngⅡ1×10-5mol/L組圖2 各組巨噬細胞核內NF-κBp65的表達

2.3巨噬細胞MIF mRNA的表達 與對照組(1)相比，AngⅡ組MIF mRNA表達量明顯增高(3.05±0.13)；給予PDTC后，MIF mRNA表達明顯降低(AngⅡ+PDTC組為2.01±0.10，PDTC組為1.22±0.05，P<0.01)。

3 討 論

動脈粥樣硬化的形成一直是人們關注的要點，對于其發病機制目前已經有多種學說。研究表明，炎癥在動脈粥樣硬化斑塊的發生、發展及破裂的過程中具有重要的作用。動脈粥樣硬化炎癥學說主要包括：炎癥反應介導脂質沉積于動脈壁，參與形成動脈粥樣硬化斑塊的過程；在病變處可見大量單核/巨噬細胞及活化的T 細胞；細胞免疫應答和抗體都能調控炎癥反應，促進動脈粥樣硬化的發生與發展。

巨噬細胞在動脈粥樣硬化病變中具有極為重要的作用，其貫穿于動脈粥樣硬化各時期的病變，是炎癥學說中的關鍵細胞。巨噬細胞作用主要為：通過分泌多種蛋白酶，參與細胞外基質的降解〔8〕；通過清道夫受體攝取氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，使巨噬細胞轉變為泡沫細胞；釋放生長因子刺激平滑肌細胞增殖和遷移等。由此可見，研究促進巨噬細胞聚集的因素對研究動脈粥樣硬化病變具有重要的作用。以往研究顯示基質金屬蛋白酶(MMP)的活性增加及降解彈性蛋白形成彈性蛋白肽與巨噬細胞的浸潤有關〔9〕，這只是眾多因素之一。

有研究表明，MIF有刺激巨噬細胞聚集的作用，其可在血管內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞〔10〕等多種細胞中表達。MIF在促進動脈粥樣硬化的作用中，體現在能直接增加T細胞和巨噬細胞的聚集〔11，12〕，還可以誘導不穩定斑塊中MMP-1和MMP-9的表達，這表明MIF在削弱纖維帽、降解膠原蛋白及在斑塊的不穩定性中都發揮著重要作用。目前AngⅡ對MIF的調節，文獻報道的很少。研究表明，人動脈粥樣硬化斑塊內的MIF的表達量和強度與動脈粥樣硬化的分期有關。在斑塊有較多炎癥和新生血管的區域，能見到AngⅡ刺激后的單核細胞表達MIF〔13〕。本研究結果顯示，在體外實驗中，AngⅡ能上調巨噬細胞MIF mRNA的表達。NF-κB參與調節基因轉錄，并與動脈粥樣硬化的發生、發展和斑塊的穩定性密切相關。通過藥物META060抑制NF-κB通路，能抑制如白細胞介素(IL)-1β、MMP-9、巨噬細胞趨化因子(MCP)-1等THP-1細胞炎癥因子的表達〔14〕。本研究結果顯示隨AngⅡ濃度的增高，NF-κB在核內的表達也增加，并同對照組相比均有明顯差異，據此判斷AngⅡ可以調節NF-κB的核內活化程度。研究顯示，AngⅡ對THP-1細胞MMP-9的調節實驗中，NF-κB通路能被激活〔15〕，我們研究的實驗結果也證實了AngⅡ對NF-κB具有上調作用，且可以促進巨噬細胞內MIF mRNA的表達，而PDTC作為NF-κB的特異性阻斷劑可抑制這種作用。有研究發現通過用ox-LDL刺激巨噬細胞，能使其核內NF-κB表達增高，而胞質中IκB表達下降，證實了刺激因子能促進NF-κBP65入核，而PDTC可抑制這一過程〔16〕。本研究顯示PDTC作為NF-κB的阻斷劑，起到抑制AngⅡ對MIF的上調作用，也說明了AngⅡ對巨噬細胞MIF mRNA的表達可以通過NF-κB通路調節，這也說明了在AngⅡ對MIF調節過程中，NF-κB信號通路并不是唯一的通路。