蝦青素聯(lián)合人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松

雷 鳴 劉春穎 劉曉峰 孫 琳 臧衛(wèi)東 曹廣民 楊照宇 鄭文奎

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，河北 保定 071000)

骨質(zhì)疏松發(fā)病率較高〔1,2〕，其主要特點(diǎn)為骨組織微觀結(jié)構(gòu)不完整，骨密度降低〔3〕，骨組織生成和代謝的平衡被打破〔4〕，臨床上多表現(xiàn)為身體骨骼部位疼痛、長(zhǎng)骨易骨折、身高變低〔5〕等。其機(jī)制可能與雌激素調(diào)節(jié)相關(guān)〔6,7〕。對(duì)實(shí)驗(yàn)雌性動(dòng)物摘除卵巢，成功模擬了由絕經(jīng)后低雌激素水平引起的骨質(zhì)疏松〔8〕。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)來源廣泛，對(duì)產(chǎn)婦及新生兒幾乎沒有影響，且其分化、增殖能力具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)〔9,10〕，未出現(xiàn)傳代后衰老的現(xiàn)象，并有特有的胎盤屏障，羥酮結(jié)構(gòu)的蝦青素，是從深海藻體、海洋動(dòng)物中提取的胡蘿卜素〔11〕，也存在于少數(shù)的陸生植物體內(nèi)。蝦青素具有很高的醫(yī)學(xué)價(jià)值，研究者已發(fā)現(xiàn)其在心血管、抗氧化、抗癌及增強(qiáng)免疫力方面效果顯著〔12〕。本研究探討蝦青素聯(lián)合hAMSCs對(duì)雌激素下降引起的骨質(zhì)疏松的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性未孕Wistar大鼠60只，鼠齡6～8個(gè)月，體重200～280 g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。所有大鼠飼養(yǎng)條件為：23～27℃，恒溫，濕度50%～70%，喂養(yǎng)飼料：顆粒型普通大鼠飼料及消毒無菌水，讓其自由飲水和進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前1 d禁食不禁水。

1.2主要材料及來源 hAMSCs購(gòu)自河北生命科學(xué)研究院，由本實(shí)驗(yàn)室冷凍保存。L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和混合抗生素(青霉素、鏈霉素)購(gòu)自Gibcos公司，胰蛋白酶購(gòu)于Sigma公司，Ⅰ型前膠原氨基末端肽(PINP )、骨堿性磷酸酶(BAP)和尿脫氧吡啶啉(DPD)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)于上海船夫生物科技有限公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司，骨形成蛋白(BMP)4、護(hù)骨素(OPG)抗體購(gòu)于Proteintech公司，GAPDH抗體購(gòu)于Bioworld公司，二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體)購(gòu)自優(yōu)維寧生物技術(shù)公司，RIPA 裂解液購(gòu)于碧云天公司。紫外分光光度計(jì)購(gòu)于上海奧析原，二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于上海人和科技有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)于上海百研生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1體外培養(yǎng)hAMSCs 小心取出已凍存的hAMSCs(防止冷凍管爆裂)，放入37℃水浴，不間歇、輕輕搖動(dòng)冷凍管，迫使其充分融化時(shí)間1 min，融解后，放置于無菌操作臺(tái)中，吸取解凍完成的細(xì)胞懸浮液，加至預(yù)先配置好的1∶10倍稀釋的L-DMEM培養(yǎng)基。并將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，靜置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天更換新鮮培養(yǎng)液，除去未貼壁細(xì)胞，至細(xì)胞融合85%時(shí)，去除培養(yǎng)基，吸取貼壁細(xì)胞，加至培養(yǎng)皿中，3 g/L胰酶消化5 min，用已配置的等體積的10%胎牛血清低糖培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞吹打到成懸液，1 500 r/min，離心5 min，棄去上清非貼壁細(xì)胞，在新配置的無菌培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)濃度，依照上述方法進(jìn)行培養(yǎng)。2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基，第5代(P5)供于該研究，并進(jìn)行油紅O染色。

1.3.2大鼠雙側(cè)卵巢切除術(shù)及實(shí)驗(yàn)分組 無菌條件下，將需切除雙側(cè)卵巢的大鼠取俯臥位，捆綁固定大鼠四肢，將大鼠置于手術(shù)臺(tái)上，消毒，切開皮膚，分離脊柱旁1 cm、肋弓下緣1 cm的肌肉和組織，腹膜切開，見腹腔中乳白色組織，剝離后，切除雙側(cè)黃豆大小粉紅色卵巢。空白組大鼠依上述方法去腹腔卵巢大小脂肪。手術(shù)組和空白組大鼠撒青霉素粉，皮膚縫合，外切口涂抹慶大霉素消毒。

將60只Wistar大鼠平均分為四組，分別是假手術(shù)組、模型組、hAMSCs移植組及聯(lián)合組(蝦青素+hAMSCs移植)。對(duì)假手術(shù)組大鼠不切除卵巢，對(duì)模型組、hAMSCs移植組及聯(lián)合組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。術(shù)后1 w，hAMSCs移植組大鼠尾靜脈注射濃度為2×106L-1的hAMSCs細(xì)胞懸液20 μl，聯(lián)合組尾靜脈注射等量hAMSCs細(xì)胞懸液并同時(shí)灌胃20 mg/kg的蝦青素，假手術(shù)組、模型組大鼠尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液20 μl，連續(xù)干預(yù)12 w。

1.3.3檢測(cè)體重 分別于造模后的1 w、3 w、6 w、12 w對(duì)假手術(shù)組、模型組、hAMSCs移植組及聯(lián)合組大鼠進(jìn)行體質(zhì)量檢測(cè)。即將每組大鼠排便后且喂食前，放置天平上，進(jìn)行稱量，記錄大鼠體重。

1.3.4ELISA測(cè)定 PINP、BAP、DPD的含量 ELSIA固相抗體為待測(cè)樣品抗體，固相抗體與待測(cè)樣品發(fā)生特異性反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物與酶標(biāo)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，加入底物，顯色后進(jìn)行檢測(cè)。造模12 w后，隨機(jī)從假手術(shù)組、模型組、hAMSCs移植組及聯(lián)合組選3只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，斷頭取血，將血漿離心20 min，速度1 000 r/min。移液槍吸取上清液，加入酶標(biāo)包被板上，1∶10比例稀釋后，加至酶標(biāo)板孔底部，不間歇輕搖，混勻。用封板膜覆蓋后，37℃，恒溫箱，放置30 min。此時(shí)，稀釋洗滌液30倍。摘除封板膜，自然烘干，每孔各滴入洗滌液，靜止1 min后，甩干，多次重復(fù)洗滌。每孔加酶標(biāo)試劑50 μl，排除空白孔，37℃，恒溫箱，放置30 min，多次洗滌，每孔分別加入顯色劑A和B 50 μl，混勻，37℃，暗室，放置15 min后，加入終止液50 μl。快速，在分光光度計(jì)下測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的OD值。

1.3.5RT-PCR檢測(cè)BMP-4及OPG基因表達(dá)水平 總RNA從移植12 w后的骨細(xì)胞中提取，對(duì)假手術(shù)組、模型組、hAMSCs移植組及聯(lián)合組已處死的3只大鼠骨組織中，剝離股骨肌肉組織，取少量股骨粉碎后，加入含1 mg/ml亞鐵離子的PBS多次反復(fù)沖洗，用勻漿器打勻，并過100 mm濾膜，備用。按Gibco公司Trizol Total Isolation Reagent 說明書進(jìn)行提取總RNA并以總RNA mRNA為模板，參照說明書的逆轉(zhuǎn)錄酶法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在擴(kuò)增儀上進(jìn)行RT-PCR。吸取2 μl的懸浮細(xì)胞液，正反向引物各加入1 μl懸浮細(xì)胞液。BMP-4的上游引物為：5′-TGAGCCTTTCCAGCAAGTTT-3′，下游引物為：5′-AGATCCCGCATGTAATCAGG-3′，擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為341 bp。OPG的上游序列為：5′-AGTGGGAGCAGAAGACAT-3′，下游序列為：5′-TGGA CCTGGTTACCTATC-3′，擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為264 bp。內(nèi)參物GAPDH的上游序列為：5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，下有序列為：5′-TGGACTCCACGACGTACTCA-3′,擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)度為306 bp。BMP4反應(yīng)循環(huán)條件如下：94℃變性60 s，94℃退火30 s，59℃30 s，72℃ 60 s，35WH 循環(huán)，最終72℃延伸10 min〔20〕。OPG反應(yīng)循環(huán)條件如下：95℃變性1 min,57℃ 60 s，72℃ 60 s，35循環(huán)，最終70℃延伸1 min。GAPDH反應(yīng)循環(huán)條件為：94℃變性15 s，94℃ 15 s，59℃退火30 s，72℃30 s，40循環(huán)〔22〕，最終72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物10 μl于1.2%瓊脂糖凝膠電泳30 min，采用凝膠自動(dòng)成像及分析系統(tǒng)，電泳結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析電泳條帶光密度值，計(jì)算光密度與GAPDH的光比值。

1.3.6Western印跡檢測(cè)BMP-4及OPG蛋白表達(dá)水平 術(shù)后12 w，剝離假手術(shù)組、模型組、hAMSCs移植組及聯(lián)合組已處死的3只大鼠骨組織，用PBS溶液洗滌3次，加入100 μl 含有蛋白抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA細(xì)胞裂解液(預(yù)先冰浴10 min)，測(cè)定蛋白含量。4%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，15 mA電泳1 h后，取下凝膠，蛋白條帶電轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙稀(PVDF)膜，將轉(zhuǎn)移完成的PVDF膜放入培養(yǎng)皿，加入5%脫脂奶粉，浸過PVDF膜即可，封閉1 h。分別與多克隆兔抗體BMP-4和抗體OPG(1∶250)反應(yīng)，陰性對(duì)照組與GAPDH(1∶1 000)抗體反應(yīng)。一抗稀釋后放入培養(yǎng)皿中，加入PVDF膜，4℃恒溫過夜，過夜振蕩孵育后，取出PVDF膜，用TBST液沖洗多次，每次浸潤(rùn)5 min。與二抗反應(yīng)，常溫下振蕩孵育2 h，取出PVDF膜，用TBS液沖洗多次，每次浸潤(rùn)5 min。按照電化學(xué)發(fā)光(ECL)說明書操作步驟，對(duì)PVDF膜進(jìn)行熒光染色，液體A和液體B等量混合后，將其加入PVDF膜正面，反應(yīng)1 min，置于暗室10 min，曝光、顯影、定影，通過Alpha2200圖像分析儀對(duì)各組條帶掃描拍照，進(jìn)行半定量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)及采用方差分析

2 結(jié) 果

2.1hAMSCs的形態(tài)觀察 原代hAMSCs形態(tài)各異，顯微鏡可見菱形、圓形、不規(guī)則形，體積偏小，且可見少量雜質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到85%左右時(shí)，反復(fù)培養(yǎng)和傳代，本研究細(xì)胞傳至第3代時(shí)，形態(tài)較規(guī)則，多為長(zhǎng)窄梭形，體積增大，生長(zhǎng)速度增快，出現(xiàn)細(xì)胞偽足，未能觀察到雜細(xì)胞，見圖1。

2.2各組大鼠體重變化 假手術(shù)組大鼠體重增長(zhǎng)符合動(dòng)物自然生長(zhǎng)規(guī)律，術(shù)后1 w，模型組、hAMSCs移植組及聯(lián)合組體重均低于較假手術(shù)組。術(shù)后3 w，hAMSCs移植組及聯(lián)合組體重漸增，其中hAMSCs移植組增大幅度較小，大幅度增大的聯(lián)合組體質(zhì)量與假手術(shù)組較為接近，而模型組的增長(zhǎng)趨勢(shì)不明顯，見表1。

圖1 hAMSCs形態(tài)觀察(×200)

表1 各組不同時(shí)期體重變化

與模型組比較：1)P<0.05；與hAMSCs移植組比較：2)P<0.05，下表同

2.3各組PINP、BAP、DPD的含量變化 模型組DPD明顯高于假手術(shù)組，hAMSCs移植組則明顯低于模型組，聯(lián)合組又明顯低于hAMSCs移植組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。hAMSCs移植組及聯(lián)合組BAP明顯高于模型組(P<0.05)，假手術(shù)組BAP最高，聯(lián)合組接近假手術(shù)組(P>0.05)。與假手術(shù)組比較模型組PINP明顯降低，hAMSCs移植組和聯(lián)合組PINP明顯升高(P<0.05)，聯(lián)合組明顯高于hAMSCs移植組(P<0.05)，聯(lián)合組與假手術(shù)組接近(P>0.05)，見表2。

表2 各組DPD、BAP和PINP比較

2.4BMP-4及OPG mRNA表達(dá)水平 假手術(shù)組BMP-4mRNA(1.89±0.10)和OPG mRNA(1.95±0.13)表達(dá)水平最高，聯(lián)合組BMP-4mRNA(1.89±0.10)、OPG mRNA(1.79±0.14)表達(dá)水平略低于假手術(shù)組且明顯高于hAMSCs移植組(0.94±0.09，1.02±0.09)，而模型組BMP-4mRNA(0.48±0.09)和OPG mRNA(0.56±0.10)表達(dá)水平最低，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組BMP-4和OPG mRNA表達(dá)

2.5BMP-4及OPG蛋白表達(dá)水平 BMP-4和OPG蛋白表達(dá)在假手術(shù)組(1.68±0.11、1.74±0.12)、模型組(0.24±0.08、0.33±0.09)、hAMSCs移植組(0.88±0.10，0.94±0.11)及聯(lián)合組(1.57±0.12，1.68±0.14)與其相對(duì)應(yīng)的mRNA表達(dá)水平呈相關(guān)性，即假手術(shù)組BMP-4和OPG蛋白表達(dá)水平最高，聯(lián)合組和hAMSCs移植組二者表達(dá)水平依次降低，模型組最低，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組BMP-4和OPG蛋白表達(dá)

3 討 論

Ⅰ型原發(fā)性骨質(zhì)疏松是由雌激素水平低下引起的〔1〕，骨吸收的增量大于骨形成的增量，引起的微觀骨結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，骨小梁變細(xì)、數(shù)目降低、出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象〔12〕，甚至骨表面出現(xiàn)孔隙、骨表層變薄，脆性增加〔13〕，嚴(yán)重可導(dǎo)致全身骨病〔14〕。目前，研究者公認(rèn)雌激素可以調(diào)節(jié)分布于骨細(xì)胞的雌激素受體，改善成骨細(xì)胞能力，提高骨形成。hAMSCs是一種極具分化潛能的干細(xì)胞〔15,16〕，在細(xì)胞分化增生方面起到非常重要的作用〔17,18〕。PINP和BAP調(diào)節(jié)著成骨細(xì)胞中胞質(zhì)的合成和儲(chǔ)存，可靈敏地反映骨吸收情況，DPD則起到Ⅰ型膠原纖維分子間的連接作用〔19〕，與破骨細(xì)胞含量有關(guān)。Ⅰ型膠原纖維降解后，DPD作為產(chǎn)物釋放，故檢測(cè)血清中的DPD可反映機(jī)體骨吸收情況。BMP-4和OPG均有骨保護(hù)作用〔20,21〕，BMP-4分子量較小，可誘發(fā)骨形成，可促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌骨形成因子〔22,23〕。OPG是對(duì)破骨細(xì)胞起調(diào)節(jié)作用的糖蛋白，可有效減弱破骨細(xì)胞的生成并阻礙其發(fā)揮作用〔24〕。本研究顯示拆除雙側(cè)卵巢的大鼠骨密度下降，而同時(shí)聯(lián)用hAMSCs和蝦青素可扭轉(zhuǎn)大鼠去卵巢情況，可能對(duì)破骨細(xì)胞的活性起到制約作用，其原因可能與促進(jìn)了BMP-4和OPG的分泌，進(jìn)而保護(hù)成骨細(xì)胞，并抑制了破骨細(xì)胞的釋放有關(guān)。