醫用臭氧對肺纖維化大鼠的影響

李珂，張筠，張鐵栓

鄭州大學第二附屬醫院，河南鄭州 450000

特發性肺纖維化 （idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種由多種原因引起的以彌漫性肺泡炎和肺泡結構紊亂為基礎的肺間質疾病[1]，臨床癥狀表現為刺激性干咳并進行性加重的呼吸困難，疾病晚期可導致低氧血癥和心、肺等多種臟器功能衰竭[2]，死亡率高。目前發病機制尚未清楚，且臨床上缺乏有效的治療手段，目前多以皮質類固醇激素聯合免疫抑制劑為主，但是治療效果差，不能有效制止病情的進展和改善患者預后，而且存在一定的不良反應[3]。因此發現有效的治療或延緩疾病進展的方法是臨床研究的熱點與難點。該研究于2016年8月—2017年1月，選取由鄭州大學動物實驗中心提供的40只清潔級雄性SD大鼠為研究對象，采用醫用臭氧腹腔注射博來霉素致纖維化大鼠并觀察大鼠肺泡炎及肺纖維化程度、血清和 BALF中TNF-ɑ、TGF-β1水平變化及大鼠肺功能的變化，分析其在治療肺纖維化中的可行性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取由鄭州大學動物實驗中心提供的40只清潔級雄性SD大鼠為研究對象，7～10周齡，體質量（200±20）g，試劑：博來霉素注射液（浙江海正藥業股份有限公司）。儀器：醫用臭氧發生器（山東淄博悅華醫療器械有限公司），以及小動物肺功能測定系統 HX200型呼吸流量換能器 （北京新行興業科貿有限公司）。ELISA試劑盒購于上海將來實業股份有限公司。

1.2 方法

40只清潔級SD大鼠被隨機分為對照組、模型組、激素組及試驗組，每組10只，實驗條件下飼養7 d，其中模型組、激素組、試驗組中的大鼠按照5 mg/kg（體質量）的劑量于氣管內滴入博來霉素（BLM A5）（國藥準字H20055883）制作肺纖維化模型，對照組以相同方法于氣管內滴入同等體積的生理鹽水（國藥準字H20056626），注入后及時將大鼠旋轉直立使藥液在肺內分布均勻。

1.3 藥物干預

氣管內滴入藥物24 h后，每日給予藥物干預1次，試驗組給予腹腔內注射醫用臭氧，醫用臭氧濃度為60 μg/mL，激素組給予 1.4 mg/kg地塞米松（國藥準字H12020516）灌胃，對照組與模型組給予相同體積的生理鹽水（國藥準字H20056626）灌胃，持續28 d后處死并收集標本。

1.4 肺功能測定

全部大鼠在注入博來霉素第28天時腹腔注射速眠新Ⅱ麻醉大鼠，固定在鼠板上，沿氣管前正中逐層分離皮膚，暴露氣管，在氣管軟骨環間水平剪切氣管，插入Y型管，連接HX200型呼吸流量換能器，采用AniRes2005動物肺功能分析系統測定大鼠第0.2秒用力呼氣容積(FEV0.3)、第0.2秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV0.2/FVC)及呼氣峰流速(PEF)。

1.5 標本的留取

測定肺功能后全部大鼠右心室采血用于TNF-ɑ、TGF-β1的檢測，結扎右側肺門，分離出雙肺和氣管。右肺用生理鹽水漂洗干凈，置于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h，取材、切片、HE染色，大鼠放血完畢后左肺行肺泡灌洗，分離出氣管在下段做一T形切口，采用外徑約1.5 mm的氣管插管插入氣管，若在過程中遇到阻力，說明到達氣管隆突部位，此時向左旋轉插管并稍微用力即可進入左主支氣管，如果重新遇到阻力說明已到達左主支氣管分叉處，插管結束。無菌注射器抽取約4℃的生理鹽水2.5 mL通過插管緩慢地注入到肺內，并停留約30 s，并緩慢回抽再反復注入肺內，約3次，最后將回抽液體抽取到15 mL塑料離心管中，此為第1次灌洗液，此后重復操作4次，將灌洗液收集到同一個塑料離心管中待測。

1.6 標本的觀察與檢測

1.6.1 病理學觀察 肺組織切片、HE染色，在光學顯微鏡下觀察肺組織形態結構的變化，根據文獻[4]的報道對肺組織的肺泡炎及纖維化程度進行分級，轉為計量資料。其中0級：無肺泡炎及肺纖維化；1級：輕度肺泡炎或肺纖維化，受累面積少于全肺組織的20%；3級：中度肺泡炎或肺纖維化，受累面積為全肺的20%～50%；4級：重度肺泡炎或肺纖維化，受累面積大于全肺的 50%，依次記為 0、1、2、3 分。

1.6.2 酶聯免疫吸附法 （ELISA法）測定大鼠血清、BALF中TNF-ɑ、TGF-β1水平 取少量灌洗液在顯微鏡下計數，其余BALF無菌過濾至無菌離心管中離心，4℃，1 000 r/min,取上清液 5 mL，利用 ELISA 法測定血清和 BALF中 TNF-ɑ、TGF-β1水平。

1.7 統計方法

所有數據均應用SPSS 21.0統計學軟件進行處理，計量資料應用均值±標準差（±s）表示，用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組肺功能的比較

與對照組相比，模型組、激素組與試驗組肺功能下降明顯，差異有統計學意義（P<0.05），其中模型組、激素組肺功能下降較試驗組明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。 見表 1。

表1 各組大鼠肺功能的比較（±s）

表1 各組大鼠肺功能的比較（±s）

組別 F E V 0.3(m L) F E V 0.3/F V C(%) P E F(m L/L)對照組（n=1 0）模型組（n=1 0）激素組（n=1 0）試驗組（n=1 0）5.9 0±0.5 2 3.3 6±0.3 3 4.2 6±0.3 5 5.0 3±0.4 8 7 8.1 5±2.1 1 4 2.9 8±1.9 1 5 0.3 8±2.0 4 6 0.9 3±1.8 1 3 8.8 2±1.4 4 2 1.9 0±1.5 6 2 6.9 5±1.2 1 3 4.3 2±1.6 3

2.2 各組病理學評分的比較

在第28天時對大鼠肺組織切片肺泡炎及肺纖維化程度進行分級評分并統計分析，結果顯示，與對照組相比，模型組、激素組與試驗組病理評分均大于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組相比，激素組與試驗組病理評分明顯小于模型組，且試驗組評分下降明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組肺泡炎和肺纖維化程度比較[（±s），分]

表2 各組肺泡炎和肺纖維化程度比較[（±s），分]

組別病理評分對照組（n=1 0）模型組（n=1 0）激素組（n=1 0）試驗組（n=1 0）0.0 0±0.0 0 2.8 0±0.4 2 2.1 0±0.7 4 1.4 0±0.5 2

2.3 各組血清、BALF中 TNF-ɑ、TGF-β1的比較

與對照組比較，模型組、激素組、試驗組大鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-ɑ、TGF-β1明顯增高，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組相比，激素組、試驗組大鼠血清及肺泡灌洗液TNF-ɑ、TGF-β1明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）,其中試驗組下降更明顯。見表3。

表3 各組血清、BALF 中 TNF-ɑ、TGF-β1的比較[（±s），pg/mL]

表3 各組血清、BALF 中 TNF-ɑ、TGF-β1的比較[（±s），pg/mL]

組別對照組（n=1 0）模型組（n=1 0）激素組（n=1 0）試驗組（n=1 0）血清T N F-ɑ T G F-β 1 B A L F T N F-ɑ T G F-β 1 1 0.0 7±0.6 4 2 8.5 8±1.4 8 1 8.1 4±1.6 7 1 2.0 3±1.4 4 6 2.9 1±1.1 6 9 6.1 1±1.5 6 8 5.0 6±1.9 7 7 5.4 1±1.9 3 1.5 0±0.0 3 2.8 9±0.1 3 1.9 5±0.7 2 1.7 5±0.5 3 1 1.9 7±0.9 4 2 3.1 3±1.4 5 1 7.9 8±0.7 9 1 5.1 0±0.7 4

3 討論

特發性肺纖維化（IPF）是一種原因不明、慢性進行性的肺間質性疾病，病理基礎主要以彌漫性肺泡炎、肺泡結構紊亂、肺間質纖維化為主[1]。一旦形成肺纖維化推薦的治療方法是肺移植，但是成本高、不良反應多、條件有限。大多數肺纖維化患者病情進展快，預后較差，生存期短，以前大多采用激素及免疫抑制劑治療，但療效欠佳，不良反應大。因此發現有效的治療或者延緩病情進展的方法迫在眉睫。

在肺纖維化的病程中，因為肺損傷產生的炎癥區域會出現中性粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞等的浸潤，這些炎性反應進而產生IL-1、TNF-α等細胞因子，炎性介質和細胞因子組成了一個復雜的網絡系統，調控肺泡上皮細胞和成纖維細胞增值和凋亡，促進肺纖維化的發生[5]。TNF-ɑ是一種具有多種生物活性的細胞因子，主要是由單核-巨噬細胞分泌，在肺損傷時可以高度表達，一方面可以促進白細胞趨化聚集，發揮促炎作用，促進成纖維細胞增值，另一方面激活中性粒細胞和嗜酸性粒細胞等的功能，刺激產生超氧化物，釋放溶酶體酶，對其周圍細胞產生毒性作用[6-7]。TNF-ɑ可以誘導人成纖維細胞膠原mRNA的表達，并促進血小板的聚集，進一步釋放促纖維化細胞因子，比如 TGF-β1、血小板衍生生長因子（PDGF）等[8]。 TGF-β1是分子量為 25 kD 的多肽，由 2條分子量為11 kD的亞單位通過二硫鍵連接而成，主要由肺泡巨噬細胞和上皮細胞分泌。TGF-β1在多種細胞因子構成的網絡系統中起著主導作用，它可以促進TNF-ɑ、IL-6、PDGF等的高表達，從而導致肺成纖維細胞的增值和纖維增生[8]。TGF-β1可促進纖維細胞激活向肌成纖維細胞轉化，可導致多種器官比如肝、腎纖維化和動脈粥樣硬化[9]。因此測定血清及肺泡灌洗液中TNF-α、TGF-β1的水平，再結合肺組織病理切片和肺功能結果，可以在一定程度上反應肺纖維化程度。

臨床上醫用臭氧可以用于腰椎間盤突出癥、創傷及難治性潰瘍、病毒性肝炎、癌癥等的治療。有報道稱，肺纖維化與機體內氧自由基的代謝紊亂有關，如果體內缺乏清除氧自由基的過氧化物酶，則會加速肺纖維化的進程[10]。醫用臭氧可以促進體內多種抗氧化酶的產生，如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等，清除氧自由基，降低氧自由基對細胞的損傷[11]。文獻[12]中同樣應用醫用臭氧提高了大鼠肺組織中超氧化物歧化酶的含量，并降低了羥脯氨酸的含量，提示醫用臭氧能改善機體對氧自由基的清除能力。另外通過測定肺纖維化評分(1.2±0.4)分與肺功能證明醫用臭氧可以改善大鼠肺功能，降低肺纖維化程度，在纖維化評分與肺功能的對比上與該次研究結果相符。醫用臭氧同時被證明具有抗炎作用，它不僅能刺激拮抗炎癥反應的細胞因子和免疫抑制因子釋放，而且刺激細胞內皮釋放NO和PDGF等引起血管擴張，促進炎癥吸收，同時還具有一定的抗感染能力[12]。而肺纖維化患者往往多同時合并有細菌或者真菌感染。該研究結果顯示，試驗組大鼠通過腹腔注射臭氧，TNF-α、TGFβ1水平下降明顯，結合肺功能及肺組織病理結果，進一步證明了醫用臭氧能減輕肺纖維化中程度。相關機制可能是醫用臭氧具有的高度的氧化性刺激了體內抗過氧化酶的過度表達，促進氧自由基的清除，拮抗炎癥介質的細胞因子產生增多。緩解了肺纖維化的進一步加劇[13]。

綜上所述，醫用臭氧能有效抑制肺纖維化大鼠血清及肺泡灌洗液中TNF-α、TGF-β1的釋放，緩解肺纖維化病程，可能這是醫用臭氧治療肺纖維化的機制之一，且具有經濟、安全等優勢，對于肺纖維化的治療具有一定前景。