1 株水開菲爾粒中植物乳桿菌的鑒定及產細菌素基因分析

梁新紅，冉軍艦,*，孫華迪，趙瑞香，焦凌霞，盧艷清

（1.河南科技學院食品學院，河南省高校重點實驗室培育基地，新鄉市農產品加工工程技術研究中心，河南 新鄉 453003；2.河南科技學院新科學院，河南 新鄉 453003）

食品安全是影響食品質量的重要方面，其中食源性微生物引發的疾病在發達和發展中國家均廣泛存在，嚴重威脅公共健康。經過多年研究，與危害人類健康相關的食品病原微生物已經得到鑒定，比如腸炎沙門菌（Salmonella enteritidis）和大腸桿菌（Eschericia coli），這兩種菌引起75%的食源性疾病[1]。通過抗生素可以抑制病原菌的生長，但是抗生素的濫用使病原菌產生耐藥性，嚴重威脅人類的健康，所以天然抑菌物質得到越來越多的重視。細菌素是由乳酸菌產生的具有抑菌活性肽類或蛋白類物質，可用于食品的防腐。產生細菌素的菌種來源于食品、動物、植物和臨床樣品[2-8]，而且不同的菌種產生的細菌素種類不盡相同，如Nisin（Lactococcus sp.）、Pediocin（Pediococcus sp.）、Lactocin（Lactobacillus sp.）、Enterocin（Enterococcus sp.），革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌產生更多種類的細菌素[9-12]。細菌素因具有獨特的抑菌機制且無毒、無殘留、無抗藥性的特點受到了越來越多的關注。目前已有多種細菌素已經被分離鑒定，比如Subtilin、Cerein、Thuricin、Plantaricin[13]。但是到目前為止只有Nisin（Lactococcus lactis）、Pediocin（Pediococcus acidilactici）等少量的細菌素作為商業生產，其他細菌素仍處于實驗階段，所以細菌素作為添加劑或者化學抗菌劑的替代品具有很大潛力，可以廣泛的應用在食品行業。水開菲爾是一種自然發酵的飲料，具有改善人體胃腸道蠕動、增強身體免疫力的作用，在全球范圍廣泛飲用[14-18]。將水果、水、糖和開菲爾粒混合無氧發酵2～4 d即可獲得水開菲爾[19-20]，在發酵后期，水開菲爾粒在水開菲爾中形成，通過過濾將水開菲爾粒分離重復利用。水開菲爾粒易碎，由胞外多糖組成，并含有多種微生物[21-23]。近些年來，有研究關注于水開菲爾粒發酵過程的微生物菌落動力學、生物多樣性和代謝組學，通過研究證明在水開菲爾發酵過程中起主要作用的是乳酸菌，如副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）、希氏乳桿菌（L.hilgardii）和植物乳桿菌（L. plantarum），以及酵母，如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等[24]。

本研究從水開菲爾粒中分離出1 株具有抑菌活性的菌株，以該菌為研究對象，對該菌株所屬菌種、所產細菌素相關基因進行鑒定，并對其編碼基因進行分析。研究結果為該菌株和其細菌素的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株QF01從水開菲爾分離并于實驗室保藏；大腸桿菌（Escherichia coli JM109）為實驗室保藏菌種。

MRS液體培養基：蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸氫二銨2 g、Mg2SO4·7H2O 0.58 g、K2HPO42 g、硫酸錳0.25 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1 000 mL，微調pH 6.5；MRS固體培養基：固體培養基加瓊脂15 g/L，用于QF01菌的培養。

LB液體培養基：蛋白胨10 g/L，酵母浸膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0；LB固體培養基：固體培養基加瓊脂15 g/L，用于E. coli JM109的培養及乳酸菌細菌素活性測定。

1.2 儀器與設備

ZHWY-211C恒溫振蕩培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；JB-CJ-800超凈臺 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司；JY600電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司；GelX1650凝膠成像分析系統 上海歐翔科學儀器有限公司；Labcycler Standard Plus聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

在超凈工作臺中活化低溫保藏的菌種QF01，將菌種劃線于MRS固體培養基，在37 ℃條件下培養過夜，挑平板上的單菌落置于10 mL MRS液體培養基中，在培養溫度37 ℃、搖床轉速180 r/min條件下培養12 h。

1.3.2 抑菌活性測定

采用牛津杯法測定：取指示菌液100 μL均勻涂布于LB固體培養基上，放置牛津杯，在杯中注入細菌素樣品50 μL，菌株QF01產生的細菌素由硫酸銨沉淀法獲得[25]。在4 ℃條件下靜置過夜，待細菌素充分擴散后放入37 ℃培養箱培養12～16 h，觀察抑菌圈大小，以磷酸緩沖液（pH 6.8）為對照每個實驗重復3 次。

1.3.3 引物設計

各細菌素基因PCR合成引物參考文獻[26]，擴增的各基因引物序列如表1所示，設計的引物在上海生工生物工程有限公司合成。

表1 11 對引物序列Table 1 Sequences of 11 pairs of primers used for PCR

1.3.4 PCR擴增

用菌株QF01的DNA作為PCR的模板，對細菌素相關基因進行PCR檢測。反應體系為25 μL，包括DNA模板1 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP 2 μL，Mg2+1.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，rTaq 0.125 μL，ddH2O 16 μL。細菌素相關基因的PCR擴增條件為：預熱溫度95 ℃，時間5 min；解鏈溫度95 ℃、時間30 s，退火溫度53 ℃、時間30 s，延伸溫度72 ℃、時間90 s，循環30 次；溫度72 ℃再延伸5 min。擴增結束后取5 μL擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠、1×TAE緩沖液中進行電泳，在130 V電壓下，電泳30 min后，取出膠在EB染色池中染色15 min，然后通過紫外凝膠熒光掃描儀檢測。將PCR產物純化后連接到pMD-19T克隆載體上，轉入E. coli DH-5α感受態細胞。在氨芐抗生素的LB平板上涂布培養，挑單菌落PCR鑒定，將獲得的陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3.5 序列分析

利用NCBI網站BLAST程序對產物序列進行同源性搜索，分析其保守序列并利用MEGA 5.1構建系統發育樹；使用ProParam tool（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）對其基因編碼產物的理化性質進行分析；利用TMHMM 2.0在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對QF01細菌素合成必需基因編碼產物的氨基酸序列進行跨膜螺旋信號分析；利用在線軟件（http://www.ebi.ac.uk）中的InterProScan工具對QF01細菌素合成必需基因編碼產物的氨基酸序列結構域預測；利用在線軟件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/）中的SOPM工具進行蛋白質二級結構預測；通過ExPASy（http://ca.expasy.org/）提供的SWISS-MODEL在線工具對蛋白質進行同源建模，查看空間模型[27]。

2 結果與分析

2.1 抑菌活性

菌株QF01發酵上清液中的細菌素作用于大腸桿菌，如圖1所示，通過與對照組相比較，發酵上清液具有抑菌作用。

圖1 菌株QF01產細菌素抑制大腸桿菌效果Fig. 1 Inhibitory effect of bacteriocin produced by strain QF01 against E. coli

2.2 菌株QF01基因組DNA提取分析與菌種鑒定

提取菌株QF01總DNA通過瓊脂糖凝膠電泳，提取的QF01總DNA條帶清晰，沒有雜條帶，片段大小在20 000 bp左右，以此基因組DNA作為16S rDNA的PCR擴增模板，得到菌株QF01的16S rDNA片段。

圖2 菌株QF01 16S rDNA PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification product of 16S rDNA from strain QF01

如圖2所示，16S rDNA引物擴增后的條帶在1 400 bp左右，將PCR產物送往測序公司進行測序。測定的菌株QF01的16S rDNA序列結果提交至NCBI中的BLAST進行對比，選取部分乳桿菌屬標準菌株的16S rDNA序列共8 個，用軟件MEGA 5.1構建菌種系統發育樹。從圖3可看出，該菌與L. planrarum strain Z55同源性最高，可初步確定該菌株為植物乳桿菌。

圖3 菌株QF01 16S rDNA的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain QF01 based on 16S rDNA sequence

2.3 細菌素合成基因鑒定

利用設計的11 對引物進行PCR擴增結果見圖4。通過觀察，發現只有plnD、plnEF、plnR、plnV擴增出現產物條帶，將PCR產物回收測序，進行DNA序列的生物信息學分析。其他基因沒有擴增出條帶，可能是因為該菌不含有這些細菌素的基因。

圖4 L. planrarum QF01細菌素相關基因PCR擴增電泳圖Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of the bacteriocin-related genes of L. planrarum QF01

2.4 氨基酸序列比對分析

利用NCBI網站中的BLAST對植物乳桿菌QF01細菌素合成基因（plnD、plnEF、plnR、plnV）進行比對，發現PlnD、plnEF、plnR、plnV與植物乳桿菌相關基因核苷酸序列一致性達到96%～100%，這表明植物乳桿菌中plnD、plnEF、plnR、plnV基因的核苷酸序列有高度保守性。采用鄰位相接法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹如圖5所示，圖中數字為Bootstrap 1 000 次的置信度，4 個pln系列基因在各自的發育樹中均與植物乳桿菌聚類，表明4 個基因的氨基酸序列在相同物種親緣關系較近，存在著共同進化模式，可為乳桿菌各物種的分類提供依據。

圖5 植物乳桿菌QF01四種細菌素基因氨基酸序列系統發育樹Fig. 5 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of four bacteriocin genes of L. plantarum QF01

2.5 相關基因編碼產物理化性質分析

在線軟件蛋白預測結果顯示，plnD基因的編碼產物蛋白質的分子質量為23 743.20 ku，氨基酸數為206，理論pI值為5.17，脂肪族氨基酸指數101.80，總平均親水性-0.270，不穩定系數28.50，根據不穩定系數大于40則該蛋白結構不穩定的標準[28]，說明該蛋白質是穩定的。plnEF基因的編碼產物蛋白質的分子質量為6 960.90 ku，氨基酸數為63，理論pI值為9.99，脂肪族氨基酸指數85.08，總平均親水性-0.192，不穩定系數15.82，說明該蛋白質是穩定的。plnR基因的編碼產物蛋白質的分子質量為3 288.62 ku，氨基酸數為234，理論pI值為5.75，脂肪族氨基酸指數56.15，總平均親水性-0.692，不穩定系數49.76，說明該蛋白質不穩定。plnV基因的編碼產物蛋白質的分子質量為25 022.97 ku，氨基酸數為226，理論pI值為9.65，脂肪族氨基酸指數132.29，總平均親水性0.951，不穩定系數20.88，說明該蛋白質是穩定的。上述分析是軟件預測結果，需要進一步表達純化出細菌素進行驗證。

2.6 跨膜螺旋信號分析

由表2可知，只有plnV基因編碼產物的跨膜螺旋中的氨基酸殘基數大于18[29]，前60 個氨基酸跨膜螺旋中的殘基數44 個（圖6），說明plnV基因編碼產物可能存在跨膜序列，且蛋白的N端存在信號肽。在PDB（Protein Data Bank）數據庫中只有1%左右的跨膜蛋白結構[30]，膜蛋白在細胞和外界環境、細胞與細胞之間的信息識別、物質交流及運轉中起著不可替代的作用，所以plnV基因在細菌素合成過程中起著非常重要的作用，可深入研究。plnD、plnEF和plnR基因編碼產物均無跨膜區域和信號肽，說明這3 種基因編碼產物合成后不進行蛋白轉運，保留在細胞基質，易于提取分離。

表2 L. planrarum QF01細菌素相關基因編碼產物的氨基酸跨膜螺旋數據Table 2 Analysis of amino acid trans- membrane helix of products encoded by bacteriocin genes in L. planrarum QF01

圖6 plnV基因編碼產物蛋白質序列跨膜螺旋預測分析Fig. 6 Prediction of the transmembrane helixes of plnV encoding product

2.7 結構域分析

通過在線軟件分析可知，在plnD基因編碼產物序列中有信號傳導響應調節接收器特征結構域，位于第2～129個氨基酸之間（圖7），該結構域是群體效應中調控細菌素合成的反應調節器特征結構，對調節基因啟動子有重要的作用；在plnEF、plnR、plnV基因編碼產物序列中均沒有家族結構特征。

圖7 L. plantarum QF01 plnD編碼產物預測結構域Fig. 7 Predicted domain of plnD-encoding product

2.8 二級結構和三級結構分析

表3 L. plantarum QF01細菌素合成相關基因編碼產物的二級結構分析Table 3 Analysis of secondary structures of proteins encoded by the bacteriocin-related genesof L. plantarum QF01

如表3所示，plnD、plnEF、plnR和plnV基因的編碼產物中均存在α-螺旋、伸展鏈、β-轉角和無規則卷曲，其中α-螺旋在4 種基因編碼產物中所占比例最高。plnD基因編碼產物中有85 個氨基酸形成α-螺旋，占所有氨基酸的41.26%，plnEF基因編碼產物中有29 個氨基酸形成α-螺旋，占所有氨基酸的49.15%，plnR基因編碼產物中有101 個氨基酸形成α-螺旋，占所有氨基酸的43.16%，plnV基因編碼產物中有114 個氨基酸形成α-螺旋，占所有氨基酸的50.44%。

將4 種氨基酸序列進行同源建模，結果如圖8所示。plnD編碼產物模型與DNA結合的反應調節器蛋白模型同源性最高（22.5%），該蛋白是細菌素合成的調節因子；plnEF編碼產物模型與細菌素PlnF蛋白模型同源性為100%，plnE起到調控乳酸菌產生細菌素的作用；plnR編碼產物模型與甲酸通道蛋白模型同源性為10.89%；plnV編碼產物模型與Ras轉化酶1蛋白模型同源性為22.73%，該蛋白是一種膜內蛋白酶，能阻斷Ras通路傳導信號。其中plnEF編碼產物同源性最高，另外3 種模型同源性較低。在圖8中能明顯看出蛋白二級結構α-螺旋所占比例較大，對比空間結構的元件及分布，證明二級結構和三級結構結果一致，表明模型的可信度較高。

圖8 L. plantarum QF01相關基因編碼產物的三級結構Fig. 8 Tertiary structures of proteins encoded by the bacteriocinrelated genes of L. plantarum QF01

3 結 論

本研究從水開菲爾粒中分離鑒定出1 株具有抑菌效果的植物乳桿菌QF01，利用已報道細菌素相關基因的11 對特異性引物對植物乳桿菌QF01全基因組DNA進行PCR擴增、測序，發現該菌基因組中存在plnD、plnEF、plnR和plnV基因，并獲得了4 種細菌素基因序列，通過生物信息學分析得知4 種細菌素氨基酸序列，確定plnR基因編碼產物結構不穩定，plnD、plnEF和plnV基因編碼產物結構穩定。跨膜螺旋信號分析得知plnV基因編碼產物可能存在跨膜序列，且蛋白的N端可能存在信號肽，由于跨膜蛋白在生命體內有著重要的作用，所以plnV基因編碼產物可進行深入研究。因此，本研究利用分子技術鑒定細菌素的方法可以為食品安全提供材料，而且為細菌素外源表達提供理論支持。