高穩定性鴨肝多肽飲品的配方優化及其抗氧化性能

王 立，鄒 燁*，張新笑，陳 琳，吳海虹，王道營*

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

鴨肝屬鴨科動物家鴨的肝臟，系鴨副產物之一，大小呈雙葉狀、色紫紅、質地嫩[1]。鴨肝是一種營養豐富的食品，富含蛋白質、脂肪、糖類、維生素等[2]，同時含有超氧化物歧化酶，具有明顯的抗脂質氧化及抗衰老作用[3-4]，在一定程度上保護細胞及組織不受損傷，具有很高的應用價值。鴨肝含豐富的鋅、鐵、硒等微量元素[5]，其中硒是重要的功能營養物質，具有預防心血管疾病等重要功能[6]。鴨肝多肽是鴨肝經酶解作用后，由許多分子鏈長度不等的小分子肽組成的混合物，研究發現多肽在人體新陳代謝方面具有重要的生理功能，人體對它的消化吸收優于大分子蛋白質及小分子游離氨基酸[7]。此外多肽不僅能提供人體生長、發育所需的必需氨基酸[8]，同時還具有調節機體代謝機能[9]，清除多余自由基[10]、增強人體免疫力等重要作用[11]。但到目前為止，國內對鴨肝的加工方式多為簡單烹飪后食用，國外等加工企業多用于魚飼料[12]，導致鴨肝的利用率較低，若將這部分鴨肝資源經水解配制多肽，制備新型保健飲品，其經濟、環境、社會效益是極其可觀的。

評價飲品體系質量的指標較多，穩定性是影響飲品質量的一個重要因素，直接影響其感官及飲用效果和營養價值[13]。影響飲品穩定性的因素有很多，如分散相的濃度、pH值、微生物生長等，這些因素單獨或共同影響了飲品的穩定性[14]。本實驗以鴨肝為原料，在單因素試驗基礎上，通過響應面試驗方法優化其配方工藝，并進一步研究其氨基酸組成和抗氧化性，對鴨肝多肽的深加工提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨肝 南京市孝陵衛農貿市場；2,2’-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS） 薩恩化學技術（上海）有限公司；啡啰嗪、胰酶（生物純，1∶4 000） 上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HJ-8（DF-1）集熱式磁力攪拌器、HH-8數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；JYL-D001料理機九陽股份有限公司；Uncen MR臺式冷凍離心機 德國Hero Lab公司；M124A電子天平 意大利Mark倍爾機電有限公司；便攜式pH計 美國奧豪斯公司；SCIENTZ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；冷凍干燥機 德國Christ公司；均質機 常州市常樂乳品機械廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫藥器械廠。

1.3 方法

1.3.1 鴨肝多肽飲品的制備工藝流程

新鮮鴨肝→切丁→勻漿（10 000 r/min勻漿2 次，每次20 s，間隔10 s）→滅酶（90 ℃，15 min）→異丙醇脫脂（10%，靜置12 h）→離心取沉淀（5 000×g，10 min）→干燥→鴨肝粗品→超聲輔助提取（超聲功率150 W，超聲時間5 min，料液比1∶60（g/mL））→酶解（胰酶2 000 U/g，130 min）→滅酶（90 ℃，15 min）→離心（5 000×g，15 min）→取上清液→真空冷凍干燥（-45 ℃，0.06 mbar，40 h）→鴨肝多肽→調配（白砂糖、果膠）→均質（60 ℃，20 MPa）→滅菌（95 ℃；15 min）→灌裝→滅菌（95 ℃，15 min）→冷卻→成品

1.3.2 穩定系數的測定

在刻度離心管中準確加入飲料50 mL，以3 000 r/min離心15 min，取上清液稀釋100 倍后，于750 nm波長處測吸光度A2，與離心前的稀釋100 倍測定的吸光度A1的比值即為穩定系數R[15]，計算如式（1）所示：

根據此經驗公式，R值越大（極限為1），說明飲料的穩定性越好。

1.3.3 鴨肝多肽飲品配方優化

1.3.3.1 單因素試驗

按工藝流程方法制備鴨肝蛋白多肽，選擇鴨肝多肽添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、白砂糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%）、果膠添加量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）3 個因素進行單因素試驗，在白砂糖添加量和果膠添加量固定于8%、0.1%的條件下，研究鴨肝多肽添加量對多肽飲品穩定性的影響；在鴨肝多肽添加量和果膠添加量固定于2%、0.1%的條件下，研究白砂糖添加量對多肽飲品穩定性的影響；在鴨肝多肽和白砂糖添加量固定于2%、8%的條件下，研究果膠添加量對多肽飲品穩定性的影響；以鴨肝多肽飲品的穩定系數（R）為考察指標，探究各因素對鴨肝多肽飲品穩定性的影響。

1.3.3.2 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇鴨肝多肽添加量、白砂糖添加量、果膠添加量3 個因素，以鴨肝多肽飲品穩定系數（R）為響應值，根據Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken法設計響應面試驗方案，其相應的因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken設計因素和水平Table 1 Factors and levels used for Box-Behnken design

1.3.4 鴨肝多肽飲品氨基酸測定

樣品處理：采用鹽酸水解法對樣品進行處理，稱取鴨肝多肽于水解管中加入8 mL 6 mol/L的HCl溶液，真空封管后于110 ℃的烘箱內水解24 h，將水解液定容至25 mL進行過濾，取濾液1 mL于小燒杯中，真空干燥后加入1 mL 0.02 mol/L的HCl溶液，靜置1 h，倒入1.5 mL的離心管中于10 000 r/min離心10 min，取100 μL至Agilent專用樣品瓶內，最后上機分析[11]。

氨基酸自動分析儀檢測條件：ODS分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μL），柱溫40 ℃，反應溫度80 ℃，緩沖液流速0.225 mL/min，茚三酮流速0.3 mL/min，檢測波長為440 nm和570 nm。

1.3.5 鴨肝多肽飲品氨基酸營養評價

通過對鴨肝多肽的化學評分（chemical score，CS）和氨基酸評分（amino acid score，AAS）的計算評價其營養價值的高低[16]。CS值越接近100，表示待評價物與標準蛋白的組成就越接近，營養價值就越高。AAS值越接近100，表示待評價物與評分模式氨基酸組成就越接近，蛋白質價值就越高。

CS用來測定評價待評價蛋白質中某一必需氨基酸的含量與標準雞蛋蛋白中相應必需氨基酸含量的接近程度。計算如式（2）所示：

式中：Ax為待測蛋白質中某一必需氨基酸的含量/（mg/g）；As為標準雞蛋蛋白中相應必需氨基酸的含量/（mg/g）。

AAS為待測蛋白質中某一必需氨基酸占WHO/FAO評分模式中相應氨基酸含量的百分比。計算如式（3）所示：

式中：Ax為樣品蛋白某一必需氨基酸的含量/（mg/g）；As為WHO/FAO評分模式氨基酸的含量/（mg/g）。

1.3.6 鴨肝飲品微生物指標測定

菌落總數：參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數的測定》方法測定；大腸桿菌：參照GB 4789.3—2010《食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》方法測定；霉菌和酵母菌：參照GB 4789.15—2010《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》方法測定；沙門菌：參照GB 4789.4—2010《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》方法測定；金黃色葡萄球菌：參照GB 4789.10—2010《食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》方法測定。

1.3.7 鴨肝多肽飲品的感官評價

檢驗區環境溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%。保證空氣流通，足夠亮度。被檢測樣品（25 ℃左右）裝入形狀、大小相同的容器中，統一編號。感官評定人員為10 名（5 男、5 女）22～26 歲的不吸煙者。按表2感官指標對產品的色澤、甜味、口感、組織狀態等進行綜合感官評價。

表2 感官評定評分指標[17]Table 2 Criteria for sensory evaluation of the beverage

1.3.8 鴨肝飲品抗氧化實驗

1.3.8.1 ABTS＋·清除率的測定

ABTS溶液的配制：配制2 mmol/L ABTS儲備液與1 mmol/L過硫酸鉀溶于磷酸鹽鈉緩沖液中，混合后于4 ℃避光反應12 h備用，于734 nm波長處測定吸光度為0.80左右，即為ABTS工作液，當日現配使用。取0.1 mL多肽液，加入4 mL ABTS工作液，室溫下靜置10 min，于734 nm波長處測定吸光度A1，以去離子水代替多肽飲品測定空白吸光度A0，以磷酸鹽鈉緩沖液代替ABTS工作液測得吸光度A2[18]，實驗平行做3 次，抗壞血酸作陽性對照。ABTS＋·清除率計算如式（4）所示：

式中：A2為實驗組吸光度；A1為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.8.2 二價鐵螯合能力的測定

鴨肝多肽用去離子水溶解后配成質量濃度為0.2～2 mg/mL。取1 mL樣品加入0.5 mL 2 mmol/L的氯化亞鐵溶液，再加入1 mL 5 mmol/L的啡啰嗪，室溫反應20 min，在562 nm波長處測定吸光度為A。去離子水代替樣品溶液作空白對照測定的吸光度為B[11]。乙二胺四乙酸作陽性對照。二價鐵螯合能力計算如式（5）所示：

式中：A為實驗組吸光度；B為空白組吸光度。

1.4 數據統計與分析

實驗數據采用SPSS 16.0統計軟件進行處理，Turkey檢驗用于組間的數據分析，P＜0.05，表示兩組之間具有顯著性差異，采用Origin 8.0、Design-Expert 8.0.6作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 鴨肝多肽添加量對鴨肝多肽飲品穩定性的影響

由圖1可知，隨著鴨肝多肽添加量的提高，多肽飲品穩定性整體呈現先下降后升高的趨勢，表明鴨肝多肽添加量對飲品穩定性具有一定的影響，隨著多肽添加量的提高，多肽分子結構不能得到充分伸展，導致其分子間作用力小于多肽分子所受的重力影響，從而導致飲品的穩定性整體呈現下降趨勢[19]。當多肽添加量分別為2%、2.5%時，飲品的穩定系數分別為95.0%、94.3%，考慮飲品穩定性的前提下，選擇多肽添加量2.0%較為適宜。

圖1 鴨肝蛋白多肽添加量對鴨肝多肽飲品穩定性的影響Fig. 1 Effect of duck liver peptide content on stability of the beverage

2.1.2 白砂糖添加量對鴨肝多肽飲品穩定性的影響

圖2 白砂糖添加量對鴨肝多肽飲品穩定性的影響Fig. 2 Effect of sugar content on stability of the beverage

由圖2可知，隨著白砂糖添加量的增加，鴨肝多肽飲品穩定性呈現先上升后下降的趨勢，白砂糖添加量為8%飲品穩定性最高，表明白砂糖中含羥基較多，具有防止因其分子間作用力而聚集的分散作用[20]。隨著白砂糖添加量的增大，鴨肝多肽飲品穩定性逐漸下降，這可能是由于隨著白砂糖添加量的增大，導致多肽飲品可溶性固形物含量提高，對其體系密度有較大影響，從而導致多肽飲品的穩定性下降[21]。因此選擇白砂糖添加量為8%較為適宜。

2.1.3 果膠添加量對鴨肝多肽飲品穩定性的影響

圖3 果膠添加量對鴨肝多肽飲品穩定性的影響Fig. 3 Effect of pectin content on stability of the beverage

由圖3可知，隨著果膠添加量的增加，鴨肝多肽飲品的穩定系數呈逐漸上升趨勢，果膠添加量為0.1%，此時鴨肝多肽飲品穩定系數最高。果膠是飲品廣泛使用的穩定劑，不僅提高飲品的穩定性還可改善其口感和風味[21]。果膠屬于陰離子多糖，可與大部分多肽發生絡合形成帶負電的絡合物，利用靜電排斥作用防止其沉淀聚集，從而提高了飲品穩定性[22-23]，此后隨著果膠添加量的提高，穩定性呈下降趨勢，這可能是由于膠體與多肽相互作用聚集在一起，從而在保質期內形成絮凝，導致飲品出現分層，造成其穩定性下降[21]。考慮成本因素，選擇果膠添加量0.1%較為適宜。

2.2 Box-Behnken試驗設計及結果

根據單因素試驗結果，本研究通過響應面法中Box-Behnken試驗設計對鴨肝蛋白多肽飲品的工藝進行優化。鴨肝多肽添加量、白砂糖添加量和果膠添加量對鴨肝蛋白多肽飲品穩定性的影響較為顯著，因此選取該3 個因素作為自變量，以鴨肝多肽飲品穩定系數為響應值，進行3因素3水平Box-Behnken響應面優化試驗，結果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Box-Behnken design and experimental results

2.2.1 模型的建立及顯著分析

運用Design-Expert 8.0.6軟件對表3試驗數據進行二次多元回歸擬合，獲得響應值與自變量的邏輯關系為：

Y＝94.68＋0.36A＋0.20B-0.38C-0.44AB-7.500×10-3AC-0.18BC-1.64A2-1.66B2-0.097C2

鴨肝多肽飲品多元回歸模型的方差分析見表4。由表4可知，方程的一次項C對鴨肝多肽飲品穩定系數（Y）差異極顯著、一次項A對Y差異顯著，一次項B對Y差異不顯著；交互項AB對Y的影響顯著，交互項AC、BC對Y的影響不顯著。回歸模型差異極顯著（P＜0.000 1），響應值的相關系數R2為0.986 4，說明模型擬合良好，表明通過該模型能較好的對鴨肝多肽飲品穩定性作出預測。調整相關系數達到0.968 9，說明鴨肝多肽飲品穩定性模型能夠在96.89%的程度上解釋試驗結果，本試驗的失擬項不顯著（P＞0.05），進一步說明模型的擬合度良好。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗誤差小，能夠準確分析和預測鴨肝多肽飲品的穩定性。

表4 模型及方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

2.2.2 交互作用分析

交互項的等高線圖如圖4所示，等高線的形狀能夠反映出交互項的強弱，橢圓形表示交互顯著，而圓形相反。而響應面圖的陡峭程度可說明隨著影響因素的變化，其響應值隨之變化[24]。

圖4 不同因素交互作用的等高線及響應面圖Fig. 4 Response surface plots showing the interactive effect of ingredients on the stability of the beverage

從圖4可知，響應面圖陡峭，表明鴨肝多肽添加量和白砂糖添加量的交互作用對鴨肝多肽飲品穩定性的影響較大。從等高線圖可知，鴨肝多肽添加量對飲品穩定性的影響大于白砂糖添加量。表明鴨肝多肽添加量和果膠的相互作用對鴨肝多肽飲品的穩定性相對鴨肝多肽添加量與白砂糖添加量相互作用較小，響應面圖相對趨向圓形；果膠添加量對鴨肝多肽飲品穩定性的影響大于鴨肝多肽添加量。從圖4可知，響應面BC相對AB、AC較平穩，趨于圓形，從等高線圖可知，果膠添加量對鴨肝多肽飲品穩定性的影響大于白砂糖添加量。影響鴨肝多肽飲品穩定性的影響因素依次為：果膠添加量＞鴨肝多肽添加量＞白砂糖添加量。

2.2.3 優化提取參數和驗證實驗結果

通過響應面分析軟件，鴨肝多肽飲品的最佳配方為鴨肝多肽添加量2.0%、白砂糖添加量8.04%、果膠添加量0.09%。考慮到實驗的可操作性，將工藝參數調整為鴨肝多肽添加量2.0%、白砂糖添加量8%、果膠添加量0.09%，此時鴨肝多肽飲品穩定系數的預測值為99.246 5%，在此條件下，進行3 次平行實驗得到鴨肝多肽飲品穩定系數為99.1%，與預測值非常接近，誤差僅為0.1%，結果表明采用該模型預測鴨肝多肽飲品穩定性是可行的。

2.3 鴨肝多肽飲品氨基酸組成及營養評價

由表5可知，鴨肝多肽飲品中共檢測出17 種氨基酸，幾乎包含了蛋白質中的所有氨基酸，且含量較高。人體所需的8 種必需氨基酸中，其中檢測出7 種必需氨基酸，只有色氨酸未被檢出，非必需氨基酸檢出10 種。在所檢測的氨基酸中，谷氨酸含量最高，其次是亮氨酸。必需氨基酸中亮氨酸含量最高，其次是賴氨酸。所有氨基酸中必需氨基酸占氨基酸總量的46.39%，非必需氨基酸占53.61%，鴨肝的必需氨基酸與總氨基酸的比值（E/T）為0.46，必需氨基酸與非必需氨基酸比值（E/N）為0.86，超過FAO/WHO提出的蛋白質E/T和E/N為0.4和0.6的參考蛋白模式[25]。根據氨基酸互補性原理及營養均衡理論[26]，從表6可以看出，蘇氨酸等7 種必需氨基酸AAS均超過100，其中亮氨酸AAS最高，其次是苯丙氨酸。只有賴氨酸和蛋氨酸＋胱氨酸CS低于100，表明鴨肝中的必需氨基酸組成較為合理，尤其可以補充人體缺乏的亮氨酸和苯丙氨酸。另外，鴨肝多肽的必需氨基酸含量基本超過雞蛋蛋白，綜合CS和AAS結果，表明鴨肝多肽具有豐富的氨基酸組成，具有較高的營養價值。

表5 鴨肝多肽飲品氨基酸含量測定Table 5 Amino acid composition of duck liver peptide beverage

表6 鴨肝多肽飲品必需氨基酸評價Table 6 Essential amino acids in duck liver peptide beverage

2.4 鴨肝多肽飲品微生物指標的分析

表7 微生物指標測定結果Table 7 Microbiological indexes

由表7可知，對多肽飲品中菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母菌、致病菌（沙門菌、金黃色葡萄球菌）的檢測結果均小于國家規定[26]的蛋白質類功能保健食品中的菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母菌及致病菌。

2.5 感官評價結果分析

圖5 感官評價結果Fig. 5 Sensory evaluation

由圖5可知，鴨肝蛋白飲品在色澤、甜味、口感、組織狀態等方面較好，且產品均一、無分層、無沉淀，呈微淡黃色，甜度適中，穩定性較好。

2.6 鴨肝多肽飲品的抗氧化效果分析

ABTS＋·清除效果廣泛用于抗氧化能力的分析評價，多肽與ABTS工作液反應使其褪色，吸光度越低，表明樣品的抗氧化能力越強[27]。從圖6A可知，當質量濃度為0.2 mg/mL時，鴨肝多肽飲品清除ABTS＋·的能力高于抗壞血酸。抗壞血酸與鴨肝多肽飲品清除ABTS＋·的IC50值分別為0.016、0.035 mg/mL。Memarpoor-Yazdi等[28]從雞蛋清分離的抗氧化多肽清除ABTS＋·的IC50值為1.35 mg/mL，表明鴨肝多肽飲品具有較高清除ABTS＋·的能力。

圖6 鴨肝多肽飲品對ABTS＋·清除率（A）和二價鐵螯合能力（B）的影響Fig. 6 ABTS free radical scavenging effect (A) and ferrous chelating ability (B) of duck liver polypeptide beverage

過渡金屬離子是一種較強的自由基發生劑，在油脂的氧化過程中起著重要作用，微量的金屬離子使油脂的氧化速率提高10～36 倍。因此物質的二價鐵螯合能力是測定其抗氧化能力的重要指標[29]。由圖6B可知，鴨肝多肽飲品與乙二胺四乙酸對二價鐵螯合能力的IC50值分別為0.101 mg/mL和0.773 mg/mL。酸棗中抗氧化多肽具有較強清除不同自由基及二價鐵螯合能力等抗氧化性。Memarpoor等[30]從酸棗中提取的抗氧化多肽，其抗氧化多肽具有較強清除不同自由基及二價鐵螯合能力。當多肽質量濃度為1 mg/mL時對二價鐵螯合能力為91.5%，表明鴨肝多肽飲品對二價鐵螯合的能力較強。

以上抗氧化實驗表明鴨肝多肽飲品具有較強清除ABTS＋·及螯合二價鐵的能力，是一種有效的抗氧化劑。

3 結 論

以鴨肝多肽飲品穩定性為考察指標，通過單因素以及響應面試驗優化，建立了鴨肝多肽飲品制備的最佳配方為鴨肝多肽添加量2.0%、白砂糖添加量8%、果膠添加量0.09%，影響鴨肝多肽飲品穩定性的主次因素為果膠添加量＞鴨肝多肽添加量＞白砂糖添加量。經驗證，鴨肝多肽飲品穩定系數達到99.1%。

對鴨肝多肽的氨基酸進行檢測結果表明，鴨肝多肽含17 種氨基酸，且必需氨基酸占氨基酸總量的46.39%，表明鴨肝多肽飲品具有較高的營養價值；對飲品的微生物指標測定結果表明，各項微生物指標均符合國家標準；對飲品進行感官評價表明飲品均一、穩定性較好可放心飲用。

抗氧化實驗結果表明，鴨肝多肽飲品清除ABTS＋·的IC50值為0.035 mg/mL，與抗壞血酸相比，鴨肝多肽飲品清除ABTS＋·的效果較好，鴨肝多肽飲品對二價鐵螯合能力的IC50值為0.101 mg/mL，與乙二胺四乙酸相比，鴨肝多肽對二價鐵螯合能力更好，表現出較強的抗氧化能力。