多柔比星聯合蛋氨酸腦啡肽對神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞的生長抑制及Tau蛋白磷酸化的調節作用

曹振杰

(鄭州大學第三附屬醫院小兒外科，河南 鄭州 450052)

神經母細胞瘤是一種兒童顱外腫瘤疾病，5歲以下的嬰幼兒是其主要發病人群，抗腫瘤治療藥物的選擇對患兒預后恢復及生長發育至關重要[1]。作為常用化療藥物多柔比星可有效殺傷腫瘤細胞，但長期應用患兒耐受性差，對正常組織的不良反應亦比較大，因此成為臨床抗腫瘤治療難以克服的瓶頸[2]。蛋氨酸腦啡肽(methionine enkephalin，Met-ENK)屬于阿片類生長因子，除具有免疫調控及鎮痛作用外，還可顯著抑制腫瘤細胞生長，在多種腫瘤體外細胞試驗中具有顯著的抗腫瘤作用[3]。Tau蛋白是重要的中樞神經系統蛋白，通過磷酸化進行蛋白功能的調節，有研究[4]顯示，Tau蛋白磷酸化可加速神經細胞的凋亡。本研究主要探討多柔比星聯合Met-ENK對神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞的生長抑制作用，以及對Tau蛋白磷酸化的調節。

1 材料與方法

1.1SH-SY5Y細胞培養、分組及藥物干預神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞由中山大學附屬腫瘤醫院饋贈。SH-SY5Y細胞以含體積分數10%胎牛血清及青、鏈霉素的RPMI-1640培養基，于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養，取對數期細胞進行實驗研究。將密度為5.0×104·mL-1的SH-SY5Y細胞接種于96孔板中，培養24 h后，陽性對照組SH-SY5Y細胞以1.25 mg·L-1的多柔比星處理，低、中、高劑量實驗組SH-SY5Y細胞分別以1.25 mg·L-1的多柔比星+10-7、10-5、10-3mol·mL-1Met-ENK處理，陰性對照組細胞以等量生理鹽水處理，各組設8個復孔。

1.2MTT法[4]檢測各組SH-SY5Y細胞增殖情況干預0、24、48、72 h后，各孔加20 μL 5 mg·mL-1MTT溶液，37 ℃孵育4 h，加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，采用SpectraMax?M3多功能酶標儀檢測各孔490 nm下吸光光度值OD490 nm，計算細胞存活率=陽性對照組和各實驗組OD490 nm/陰性對照組OD490 nm×100%。

1.3流式細胞術[5]檢測各組SH-SY5Y細胞周期及凋亡情況細胞分組及處理同1.1，干預48 h后收集各組細胞，1 000 r·min-1離心10 min，加500 μL緩沖液懸浮細胞，調整細胞密度為2.0×105/孔，加5 μL Annexin V-FITC避光孵育5 min，加5 μL碘化丙啶(PI)避光孵育5 min，1 h內以FACSCalibur型流式細胞儀檢測并記錄各組SH-SY5Y細胞凋亡率及細胞周期，實驗重復3次。

1.4Hoeschest33258細胞核染色[5-6]檢測各組SH-SY5Y細胞凋亡情況細胞分組及處理同1.1，細胞培養48 h后，棄培養基，經預冷多聚甲醛固定15 min，然后加Hoeschest 33258工作液避光孵育15 min，以抗熒光淬滅劑封片，于Leica DMi8-M熒光顯微鏡下觀察陰性對照組、陽性對照組和高劑量實驗組SH-SY5Y細胞核染色情況。

1.5WesternBlot法[7]檢測各組SH-SY5Y細胞磷酸化Tau(p-Tau)蛋白表達情況細胞分組及處理同1.1，細胞培養48 h后，收集細胞，細胞裂解液裂解細胞，測定總蛋白濃度，經聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜、染色等，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，以Image J軟件分析各組SH-SY5Y細胞p-Tau蛋白表達。

2 結果

2.1各組SH-SY5Y細胞增殖情況與陰性對照組比較，干預24、48、72 h后，陽性對照組和各實驗組細胞存活率明顯降低，且各實驗組低于陽性對照組，實驗組細胞活率隨Met-ENK濃度的增大逐漸降低(P<0.05)。見圖1。

2.2各組SH-SY5Y細胞周期分布及凋亡與陰性對照組比較，陽性對照組和各實驗組凋亡率、G0/G1期細胞比例顯著升高，且中、高劑量實驗組高于陽性對照組(P<0.05)，隨Met-ENK作用濃度增加實驗組凋亡率、G0/G1期細胞比例呈逐漸升高趨勢(P<0.05)；與陰性對照組比較，陽性對照組和各實驗組S期細胞比例顯著降低，且中、高劑量實驗組低于陽性對照組(P<0.05)，隨Met-ENK作用濃度增加實驗組S期細胞比例呈逐漸降低趨勢(P<0.05)；而陽性對照組及各實驗組G2/M期細胞比例變化不顯著(P>0.05)。見表1。

表1 各組SH-SY5Y細胞周期分布及凋亡 %

注：與陰性對照組比較，1)P<0.05；與陽性對照組比較，2)P<0.05

2.3各組SH-SY5Y細胞凋亡情況Hoeschest 33258細胞核染色顯示，陰性對照組SH-SY5Y細胞核藍色熒光染色分布均勻；而陽性對照組和高劑量實驗組細胞濃縮致密，顆粒狀凋亡細胞核數量較對照組明顯增多，細胞核聚集、斷裂成塊。見圖2。

圖2 各組SH-SY5Y細胞凋亡情況(×200)

2.4各組SH-SY5Y細胞p-Tau蛋白表達情況陰性對照組，陽性對照組，低、中、高劑量實驗組細胞p-Tau蛋白相對表達量分別為0.89±0.11、0.95±0.16、1.11±0.31、1.21±0.29、1.52±0.33，與陰性對照組比較，陽性對照組和低、中、高劑量實驗組細胞p-Tau蛋白相對表達量明顯升高，中、高劑量實驗組高于陽性對照組，實驗組細胞p-Tau蛋白相對表達量隨著Met-ENK濃度的增大逐漸升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組SH-SY5Y細胞p-Tau蛋白表達情況

注：A：陰性對照組；B：陽性對照組；C：低劑量實驗組；D：中劑量實驗組；E：高劑量實驗組

3 討論

隨著人類生活方式的轉變及生活壓力的增大，惡性腫瘤的發生率不斷升高，成為嚴重威脅人類生命健康安全的事件之一，因此抗腫瘤藥物的研究成為臨床迫在眉睫的重要任務。Met-ENK是由5種氨基酸組成的天然肽類化合物，可特異性結合腫瘤細胞表面上的受體，并發揮抑制腫瘤惡性增殖的作用，同時其還具有傳統阿片生長因子所具有的免疫調控、鎮痛等藥理作用。Abate等[5]研究表明，Met-ENK對移植腫瘤細胞的裸鼠具有較好抑制腫瘤細胞生長的作用，同時可延長荷瘤動物的生存時間。楊崢維等[6]研究顯示，Met-ENK可抑制包括肝癌、肺癌、結腸癌、口腔癌、乳腺癌等在內的8種惡性腫瘤細胞的體外增殖，但其抑制強度不同，且與藥物作用時間相關。

本研究中采用MTT法檢測各組SH-SY5Y細胞增殖情況，結果顯示，干預24、48、72 h后，陽性對照組和各實驗組細胞存活率明顯降低，且各實驗組低于陽性對照組，實驗組細胞存活率隨著Met-ENK濃度的增大逐漸降低，表明Met-ENK聯合多柔比星可更有效地抑制SH-SY5Y細胞的增殖，降低細胞存活率，且具有Met-ENK劑量依賴性。李彥博等[7]研究表明，Met-ENK可將腫瘤細胞周期抑制于G0/G1期，其是通過上調抑癌基因P53、P16和細胞周期蛋白激酶相關的抑制因子P21表達，下調磷酸Rb蛋白表達而實現。本研究結果中，陽性對照組和各實驗組凋亡率、G0/G1期細胞比例較陰性對照組升高，S期細胞比例降低，同時說明Met-ENK聯合多柔比星可促進腫瘤細胞的凋亡，并將細胞阻止于G0/G1期；Hoeschest 33258細胞核染色也同樣顯示，陽性對照組和實驗組細胞凋亡現象較陰性對照組更為突出。Tau蛋白主要在神經細胞中廣泛表達，屬于微管蛋白家族成員之一，可被磷酸化、乙酰化、氧化、糖基化等修飾，其中過度磷酸化可使Tau蛋白在神經細胞內堆積，促進神經細胞損傷和凋亡[8-9]。本研究結果中，與對照組比較，陽性對照組和低、中、高劑量實驗組細胞p-Tau蛋白相對表達量明顯升高，中、高劑量實驗組低于陽性對照組，且具有一定的劑量依賴性。這表明Met-ENK可能是通過加速Tau的磷酸化促進腫瘤細胞凋亡，進而起到較好的抗腫瘤作用。

綜上所述，多柔比星聯合Met-ENK可抑制神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞的生長，并促進其凋亡，這可能與降低Tau蛋白磷酸化水平有關，但關于Met-ENK的抗腫瘤作用機制還可能存在其他的途徑，這需要臨床進一步研究加以確認。