Bacillus sp.C62的砷氧化功能及亞砷酸鹽氧化酶活力測定

楊 成，彭兆豐，陳曉明，侯新東

(中國地質大學(武漢)環境學院，湖北 武漢 430074)

砷(As)是普遍存在的污染物，來源于天然[1]和不斷增加的人為活動[2]。據報道，砷污染已成為嚴重威脅人類健康的問題，越來越多的人深受其害[3]。砷污染除了影響人體的健康外，土壤中砷的累積還會導致作物產量的下降[4]。因此，砷污染的防治已成為當前環境問題的重要議題。目前，砷污染的修復主要有物理化學方法和生物方法。在生物方法中，微生物是砷轉化和運輸的關鍵驅動力[5-7]，其生物轉化包括三價砷[As(III)]氧化、五價砷[As(V)]還原以及三價砷甲基化[5]。

由于As(III)的毒性比As(V)更高[5,8]，由砷氧化細菌介導的As(III)到As(V)的氧化作用可以降低砷的毒性[5]，因此微生物的砷氧化研究對砷污染的自然修復意義重大。微生物的砷氧化作用是由亞砷酸鹽氧化酶催化的，亞砷酸鹽氧化酶屬于二甲基亞砜還原酶家族，它由兩個異源亞基組成，一個是含有3Fe-4S簇的大亞基，另一個是含有2Fe-2S簇的小亞基[9]。與As(III)的化學氧化作用相比，其生物氧化作用更高效、經濟[10]。亞砷酸鹽氧化酶催化亞砷酸鹽氧化成砷酸鹽，氧氣作為電子受體被還原[10-11],其化學反應式如下：

(1)

本研究從位于湖南省石門縣雄黃礦區的高砷土壤中篩選出耐砷菌株C62，該菌株能有效地催化As(III)到As(V)的氧化反應，降低環境中砷的毒性。本次試驗中，首先對菌株C62進行了初步的分類鑒定；然后通過分析化學和分子生物學手段驗證了菌株C62的砷氧化功能；最后從培養的細胞中提取了亞砷酸鹽氧化酶，對酶活力的測定條件進行了優化[11-16]，并測定了菌株C62粗酶的活力，以為后續的分離純化、酶學性質表征以及實際應用奠定基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1.1.1 菌株

本試驗所用的耐砷菌株C62，由中國地質大學(武漢)分子細胞與地質微生物實驗室篩選并提供。

1.1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：2-N-嗎啡啉乙磺酸(MES)、苯基甲磺酰氟(PMSF)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、2，6-二氯酚靛酚鈉 (DCIP)，購自南京奧多福尼生物科技有限公司，均為sigma品牌；細菌生化鑒定試劑盒購自北京路橋技術股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；PCR相關試劑為TaKaRa系列；其他試劑為國產分析純。

主要儀器：恒溫培養箱(上海博迅實業有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海三申醫療器械有限公司)；UV-3200PC分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；AFS-9600原子熒光分光光度計(北京科創海光儀器有限公司)。

1. 2 菌株C62的篩選和分類鑒定

1.2.1 菌株C62的篩選和生理生化特征鑒定

菌株C62的篩選參考Lieutaud等[15]的方法，在CDM(Chemically Defined Medium)培養基[17]中添加5 mmol/L的As(III)。菌株C62的生理生化特征鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》[18]，接觸酶和甲基紅試驗等采用實驗室試劑完成，葡萄糖發酵和硝酸鹽還原試驗等采用細菌生化鑒定試劑盒完成。

1.2.2 菌株C62的16S rRNA基因序列同源性分析

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株C62的基因組DNA，作為16S rRNA基因序列擴增的模板；擴增引物采用通用引物[19]，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應程序為：首先94℃預變性5 min；然后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30次循環；最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物純化后，送武漢擎科創新生物科技有限公司測序。其測序結果利用Blast程序與NCBI數據庫中的已知序列進行比對分析。選取相關菌種的同源序列，利用軟件MEGA7構建菌株C62的系統發育樹。

1. 3 菌株C62的砷氧化功能

1.3.1 菌株C62的生長曲線測定

首先取出保存的菌種C62，在固體CDM培養基[17]上劃線進行活化；然后挑取單菌落接種于液體CDM培養基中；最后按1%的接種量接種于含5 mmol/L As(III)的CDM培養基中，于30℃恒溫培養箱中培養，轉速為150 r/min。菌株C62的生長曲線繪制采用比濁法：從0 h開始，每隔4 h取一次樣，一直取到56 h，測量600 nm處的OD600(Optical Density)值，并以培養時間為橫坐標、OD600值為縱坐標繪制菌株C62的生長曲線。

1.3.2 菌株C62的砷氧化曲線測定

砷形態分析采用原子熒光光譜法[20]。首先菌株C62在含5 mmol/L As(III)的CDM培養基中培養，從0 h開始，每隔4 h取一次樣，一直取到56 h，將不同時間所取樣品稀釋5 000倍后，分成兩份，一份測總砷含量，一份過supelclean LAC-SAX SPE柱測As(III)含量；然后測出總砷和As(III)的含量，由兩者之差計算出As(V)的含量；最后以時間為橫坐標、砷含量為縱坐標繪制菌株C62的砷氧化曲線。以不接種微生物的滅菌培養基作為試驗的對照組。

1.3.3 菌株C62亞砷酸鹽氧化酶大亞基(aoxB)基因序列的測定及同源性分析

以菌株C62的基因組DNA作為亞砷酸鹽氧化酶大亞基(aoxB)基因序列擴增的模板;擴增引物參考Quéméneur等[21]，正向引物為aoxBM1-2F：5′-CCACTTCTGCATCGTGGGNTGYGGNTA-3′；反向引物為aoxBM3-2R：5′-TGTCGTTGCCCCAGATGADNCCYTTYTC-3′。PCR反應程序為：首先94℃預變性5 min；然后94℃變性45s，52℃退火30 s，72℃延伸1.2 min，35次循環；最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物純化后，連接到載體pClone007-T上，并轉化大腸桿菌DH5α，挑選單菌落培養，陽性鑒定后送武漢擎科創新生物科技有限公司測序。其測序結果利用BlastX程序與NCBI數據庫中的已知序列進行比對分析。選取相關菌種的同源蛋白序列，利用軟件MEGA7構建菌株C62的系統發育樹。

1.4 菌株C62亞砷酸鹽氧化酶(Aro)的提取

菌株C62亞砷酸鹽氧化酶(Aro)的提取參考Anderson等[13]的方法。首先當培養基在600 nm處的OD600值達到0.6時，停止培養，4℃下以5 000×g離心30 min收集菌體，沉淀用緩沖液A (20 mmol/L Tris-HCl、0.1 mmol/L PMSF、0.6 mmol/L EDTA、0.9% NaCl，pH=8.4) 洗3次；然后按每克濕菌加5 mL提取液(50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L PMSF、0.6 mmol/L EDTA，pH=8.4)進行懸浮，并按1 mg/mL的量添加溶菌酶于室溫下孵育30 min；最后添加Mg(CH3COO)2和MgSO4至終濃度分別為20 mmol/L和100 mmol/L以及適量DNase和RNase，并超聲破碎處理15 min，超聲功率為120 W，超聲5 s、停止5 s，4℃下以20 000×g離心30 min，上清液即為菌株C62的粗酶液。

1.5 菌株C62亞砷酸鹽氧化酶(Aro)活力的測定及活性染色

菌株C62亞砷酸鹽氧化酶(Aro)活力的測定參考DCIP法[13]，采用MES緩沖體系。以2,6-二氯酚靛酚鈉(DCIP)作為電子受體，As(III)作為電子供體，PMS作為Aro和DCIP之間傳遞電子的載體；反應體系含有50 mmol/L MES、100 μmol/L DCIP、30 μmol/L PMS、2 mmol/L As(III)，pH值為6.0，檢測波長為600 nm；菌株C62粗酶活力的測定從加入As(III) 時開始，每隔30 s記錄一次分光光度計的讀數，總共監測時間為2 min。以不添加As(III)的測量作為試驗的對照組。Aro的活力定義為：25℃時，每分鐘還原1 μmol DCIP為一個酶活力單位。Aro的比活力定義為：每毫克蛋白每分鐘還原DCIP的量，單位為μmol reduced DCIP/(min·mg)，簡寫為μmol DCIP/(min·mg)。蛋白質的定量采用Bradford法[22]，以牛血清蛋白作為標準蛋白。為了減小測量誤差，所有數據測量3次。

Aro的活性還可以用活性染色的方法來檢測；活性染色采用Native-PAGE凝膠[15]，在冰浴條件下進行電泳?；钚匀旧襟E如下：首先將凝膠在50 mmol/L MES緩沖液(pH=6.0)中活化15 min，并在含500 μmol/L DCIP的MES緩沖液中避光染色1 h(4℃)；然后用MES緩沖液短暫漂洗凝膠；最后用含2 mmol/L As(III)和30 μmol/L PMS的MES緩沖液浸潤幾分鐘，直到白色條帶開始出現在藍色背景上[14-15]。

2 結果與討論

2. 1 菌株C62的分類鑒定

2.1.1 菌株C62的生理生化特征

本研究采用新鮮菌株C62進行生理生化特征試驗，其試驗結果見表1。

表1 菌株C62的生理生化特征試驗結果

注：“+”表示陽性反應；“-”表示陰性反應。

由表1可知，菌株C62的接觸酶試驗和甲基紅試驗呈陽性，V-P測定呈陰性，菌株C62可以利用D-葡萄糖和D-甘露醇產酸，可以水解明膠和淀粉，也可以利用硝酸鹽和檸檬酸鹽，但在有溶菌酶的條件下不能生長。

2.1.2 菌株C62的16S rRNA基因序列同源性分析

菌株C62的16S rRNA基因序列的擴增產物約為1 500 bp(見圖1)，測序后先將序列(1 442 bp)提交到GenBank (accession No.MF537214)，然后利用Blast程序與NCBI數據庫中的已知序列進行比對分析，再利用軟件MEGA7，采用Neighbour-Joining法(Bootstrap值設為1 000)構建菌株C62的系統發育樹，見圖2。

圖1 菌株C62相關基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of 16S rRNA gene and aoxB gene of strain C62 1-16S rRNA基因;2-aoxB基因;M-DNA marker

由圖2可見，菌株C62與Bacillusoceanisediminisstrain H2(GQ292772)處于進化樹的同一分支上，同源性達到99%，結合其生理生化特征，初步確定菌株C62屬于芽孢桿菌屬，命名為Bacillussp.C62。

圖2 基于16S rRNA 基因序列構建的菌株C62系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain C62 based on 16S rRNA gene sequences

2. 2 Bacillus sp. C62的砷氧化功能

2.2.1Bacillussp.C62的生長曲線和砷氧化曲線

Bacillussp.C62的生長曲線和砷氧化曲線見圖3。

圖3 Bacillus sp.C62 的生長曲線和砷氧化曲線Fig.3 Growth curve and arsenite oxidation curves of Bacillus.sp.C62

由圖3可見，Bacillussp.C62在30 °C下培養時，經過8 h的延滯期后進入對數生長期，在培養30 h左右生物量達到最大值，之后進入平衡期和衰亡期[見圖3 (a)]；原子熒光光譜的測量結果顯示，Bacillussp.C62在含有0.04%酵母提取物的CDM培養基中培養28 h后，可將初始濃度為5 mmol/L的As(III)幾乎完全氧化為As(V)，而滅菌對照組中的As(III)含量則沒有明顯的變化[見圖3 (b)]。

2.2.2Bacillussp.C62aoxB基因的序列分析及系統發育樹構建

aoxB基因編碼亞砷酸鹽氧化酶的大亞基，是一個有意義的分子標記，用于研究砷氧化細菌在環境中的砷氧化潛力[21]。以提取的Bacillussp.C62基因組DNA為模板，aoxBM1-2F和aoxBM3-2R為引物進行PCR擴增，在大約500 bp處有一條明亮的主帶(見圖1)，測序后先將序列提交到GenBank (accession No.MG545913)，再通過BlastX檢索分析，從數據庫中選取相關蛋白序列，運用軟件 MEGA7，采用Neighbour-Joining法(BootStrap值設為1 000)構建Bacillussp.C62的系統發育樹，見圖4。Bacillussp.C62aoxB基因序列的長度只有

圖4 基于亞砷酸鹽氧化酶基因序列構建的Bacillus sp.C62的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Bacillus sp.C62 based on protein sequence deduced from arsenite oxidase gene

Quéméneur等[21]所報道的一半，與其他菌株亞砷酸鹽氧化酶的同源性最高為36%，這可能是因為Bacillussp.C62亞砷酸鹽氧化酶的基因比較特殊，也可能是因為aoxB基因在不同的門中保守性不一致[21]，Bacillussp.C62屬于厚壁菌門，而其他菌株大多屬于變形菌門，詳細的分子機制還需要進一步研究。

2.2.3Bacillussp.C62亞砷酸鹽氧化酶(Aro)的活性染色

Bacillussp. C62菌體總蛋白(每個膠孔約50 μg)組分的Native-PAGE凝膠電泳和活性染色結果見圖5。

圖5 Bacillus sp.C62菌體總蛋白組分的Native-PAGE凝膠電泳和活性染色Fig.5 Native-PAGE and activity staining of total protein fractions of Bacillus sp.C61、2-培養基中不含As(III)；3、4-培養基中含有5 mmol/L As(III)

由圖5可見，當Bacillussp.C62在不含As(III)的條件下培養時，沒有表現出亞砷酸鹽氧化酶活性(膠孔1、2)，而當Bacillussp.C62在含As(III)的條件下培養時，就會表現出亞砷酸鹽氧化酶活性(膠孔3、4)，說明Bacillussp.C62亞砷酸鹽氧化酶基因的表達需要As(III)的誘導。這個結果與Alcaligenesfaecalis[11]和Ralstoniasp.22[12]的類似。然而，研究報道中還有一些菌種可以不需要As(III)的誘導也能表達亞砷酸鹽氧化酶活性，但是與在有As(III)條件下生長的細胞相比，其氧化活力較低[15，23]。

2.3 Bacillus sp.C62亞砷酸鹽氧化酶(Aro)活力的測定

2.3.1 亞砷酸鹽氧化酶活力測定條件的優化

由于菌種來源不同，Aro活力的測定條件也有所差異[11-16]，因此本試驗優化了一系列的試驗參數，以滿足Aro活力測定的準確度和精確度要求。

本試驗使用UV-3200PC分光光度計掃描DCIP的吸收光譜(400～800 nm)，得到不同pH值和緩沖容量下DCIP的紫外吸收光譜,見圖6。

圖6 不同pH值和緩沖容量下DCIP的紫外吸收光譜Fig.6 UV absorption spectra of DCIP at different pH and different concentrations of MES

由圖6可見，DCIP (100 μmol/L)的最大吸收峰在600 nm處[見圖6 (a)、(b)]；MES緩沖液的pH值會顯著影響DCIP的吸光度[見圖6 (a)，MES濃度為50 mmol/L]；而在給定的pH值下，MES緩沖液的緩沖容量(MES濃度為30～70 mmol/L) 對DCIP的吸光度幾乎沒有影響[見圖6 (b)，MES緩沖液的pH值為6.0]。

pH值對于Aro活力的測定是一個敏感的因素，它不但影響DCIP的吸光度，還會影響Aro的活力。pH值和緩沖容量對Aro活力的影響見圖7。

由圖7可見，在MES緩沖液的緩沖容量范圍內(pH值為5.4～6.6)，當pH值為5.8～6.0 時，Aro的活力達到最大值[見圖7 (a)，MES濃度為50 mmol/L]，考慮到DCIP在pH值為6.0時的吸收峰更窄[見圖6(a)]，靈敏度更高，最適合的pH值最終設定為6.0。此結果與先前的部分報道是一致的[13-16]。MES緩沖液的緩沖容量雖然不會影響DCIP的吸光度，但是仍會影響Aro的活力[見圖7(b)]，MES緩沖液的最佳濃度為50 mmol/L(pH值為6.0)。

圖7 pH值和緩沖容量對Aro活力的影響Fig.7 Effects of pH and concentration of MES on the activity of Aro

DCIP摩爾吸光系數的測定以及DCIP濃度、溫度和As(III)濃度對Aro活力的影響見圖8。

圖8 DCIP摩爾吸光系數的測定以及DCIP濃度、溫度和As(III)濃度對Aro 活力的影響Fig.8 Determination of the molar absorbance coefficient of DCIP and effects of DCIP concentration, and As(III) temperature on the activity of Aro

由圖8可見，DCIP在600 nm處的吸光度與DCIP的濃度存在線性關系[R2= 0.991 1，見圖8(a)]，其線性方程的斜率即為DCIP的摩爾吸光系數[6 503.5 L/(mol·cm)]；同時DCIP的濃度也會影響Aro的活力，在本試驗中，當DCIP的濃度為100 μmol/L時，Aro的活力開始接近最大值[見圖8(b)]；Bacillussp.C62酶活力測定的最適溫度為30℃，而在25℃時其活力已可達最大值的80%[見圖8(c)]，這表明可以在沒有溫度控制器的室溫條件下檢測Aro活力；As(III)是反應的底物，當其濃度達到2 mmol/L時，粗酶活力趨近于最大值[見圖8(d)]。

連續監測法測定的是酶促反應的初速率，隨著反應的進行，反應速率會逐漸降低，本試驗采用的監測時間為2 min。在Aro和DCIP之間作為電子載體的PMS，在PMS濃度較低(10～30 μmol/L)時只是起到電子傳遞的作用，不會增強反應[13]；但當PMS濃度超過80 μmol/L 時，會對Aro的活力測定造成嚴重的干擾(數據未顯示)。因此，本試驗中所使用的PMS濃度為30 μmol/L。

綜上所述，對于Bacillussp.C62，優化后的Aro活力測定條件如下：反應在室溫下進行，反應體系中含有50 mmol/L MES、100 μmol/L DCIP、2 mmol/L As(III)和30 μmol/L PMS。

2.3.2 亞砷酸鹽氧化酶(Aro)活力測定條件和粗酶活力的比較

不同菌種亞砷酸鹽氧化酶(Aro)活力的測定條件和粗酶活力(V)的比較見表2。

表2 不同菌種亞砷酸鹽氧化酶(Aro)活力測定條件和粗酶活力的比較

注：MES、As(III)的濃度單位為mmol/L;DCIP、PMS的濃度單位為μmol/L;pH值無單位；粗酶活力V的單位為μmol DCIP/(min·mg)

由表2可見，Aro活力的測定條件因菌種而各異，不同菌種的Aro在反應中對底物As(III)表現出不同的親和力；采用優化后的條件，測得Bacillussp.C62粗酶的活力為0.015 μmol DCIP/(min·mg)，與其他幾種Aro的活力接近，但顯著低于HydrogenophagaNT-14和Polaromonassp.str.GM1，而GM1是已報道的砷氧化細菌中Aro活力最強的。

3 結 論

根據菌株C62的生理生化特征和16S rRNA序列基因分析，初步確定其為一株芽孢桿菌，命名為Bacillussp.C62；砷形態分析和aoxB基因的分子檢測表明，Bacillussp.C62具有砷氧化功能，是一株砷氧化細菌，可在28 h內將培養基中的5 mmol/L As(III)幾乎全部氧化成As(V)。采用優化后的測定條件，測得Bacillussp.C62的粗酶活力為0.015 μmol DCIP/(min·mg)，可為后續的分離純化、酶學性質表征以及微生物對砷污染環境的修復奠定理論基礎。